一种检测ATP的电化学传感器及其制备方法技术

本发明专利技术涉及生物传感器技术领域，特别涉及ATP拉近Apt‑1与Apt‑2及分支HCR扩增信号检测ATP的生物传感器，在电极上依次修饰有CP‑SH层、AP层、HP1‑HP2‑HP3‑HP4层、[Ru(NH3)6]

【技术实现步骤摘要】
一种检测ATP的电化学传感器及其制备方法
本专利技术涉及电化学传感器
，特别涉及基于邻近诱导链置换和分支HCR检测ATP的电化学传感器，还涉及其制备方法。
技术介绍
三磷酸腺苷（ATP），细胞中最重要的能量来源，在细胞内新陈代谢、合成和生物化学过程中起着重要作用。值得注意的是，ATP能够指示许多人类疾病。典型的，异常的ATP浓度与一些疾病例如帕金森、低血糖、组织缺氧、局部缺血、心血管病等有着很大的关联。因此，构建一种有效的能够检测痕量ATP的分析方法是很迫切而且重要的。目前，常用的ATP检测方法包括质谱，高效液相色谱等，这些方法往往存在仪器昂贵、分析周期长、样品预处理复杂、检测费用昂贵等问题，已经难以适应ATP检测方便、快捷、灵敏度等方面的要求。因此，急需建立一种快速，准确，灵敏且高特异性的方法检测痕量ATP。
技术实现思路
为了解决以上现有技术中检测ATP的方法特异性和灵敏度都比较低、成本高的问题，本专利技术提供了一种特异性和灵敏度高、成本低、检测速度快的基于邻近诱导链置换和分支HCR检测ATP的电化学传感器。同时还提供了基于邻近诱导链置换和分支HCR检测ATP的电化学传感器制备方法。一种检测ATP的电化学传感器，在电极上依次修饰有CP-SH层、AP层、HP1-HP2-HP3-HP4层、[Ru(NH3)6]3+层；所述的AP层由均相AP溶液反应获得，原料包括Apt-1、Apt-2、AP-TP杂交双链、FP以及待测目标物；所述的CP-SH为CPHP1的5’端修饰有巯基；所述的碱基序列如下：Apt-1序列如SEQNo.1所示；Apt-2序列如SEQNo.2所示；TP序列如SEQNo.3所示；AP序列如SEQNo.4所示；FP序列如SEQNo.5所示；HP1序列如SEQNo.6所示；HP2序列如SEQNo.7所示；HP3序列如SEQNo.8所示；HP4序列如SEQNo.9所示；CP-SH序列如SEQNo.10所示。所述的电化学传感器中HP1-HP2-HP3-HP4层中HP1、HP2、HP3、HP4的摩尔比为1：1：1：1。所述的电化学传感器的制备方法，包括以下步骤：（1）对电极进行预处理；（2）将CP-SH层修饰到电极表面；（3）将AP层修饰到电极表面；（4）将HP1-HP2-HP3-HP4层修饰到电极表面；（5）将[Ru(NH3)6]3+层修饰到电极表面；（6）电化学传感器检测ATP。所述的步骤（2）将CP-SH层修饰到电极表面的操作步骤如下：将1μMCP-SH滴加10μL到经过预处理的电极表面，在37℃下孵育2h，清洗。所述的步骤（3）将AP层修饰到电极表面的操作步骤如下：S1将1XPBS缓冲液，1μMApt-1，1μMApt-2，1μMAP-TP杂交双链，1μMFP和待测目标物各2μL、灭菌水8μL加入离心管中，震荡30s，放入37℃的恒温箱中孵育2h；S2将孵育好的混合溶液滴加到修饰好CP-SH层的电极上，将电极继续放在37℃的恒温箱中孵育2h，清洗。所述的步骤（4）将HP1-HP2-HP3-HP4层修饰到电极表面的操作步骤如下：将1XPBS缓冲液，1μMHP1，1μMHP2，1μMHP3，1μMHP4各2μL加入离心管中，震荡30s，滴加到修饰AP-CP-SH层电极上，将电极继续于37℃的恒温箱中孵育2h，清洗。所述的步骤（5）将[Ru(NH3)6]3+层修饰到电极表面的操作步骤如下：将10μL50μM[Ru(NH3)6]3+滴加到第（4）步反应完成电极上，将电极继续放在37℃的恒温箱中孵育10min，清洗。所述的步骤（1）对电极进行预处理操作为电极在0.3µm和0.05µm的氧化铝浆中进行抛光处理，直到呈镜面，用PBS和二次水冲洗。所述的步骤（1）的电极为金电极。所述的步骤（6）的检测条件：以Ag/AgCl为参比电极，以Pt电极为对电极，电位设置为0到-0.5V，脉冲宽度0.05V，扫描速率为0.06s，采用差分脉冲伏安法读取电信号的变化，检测待测目标物。其中：PBS缓冲液是由传统方法配制：Na2HPO4(10mM)，NaH2PO4(10mM)，NaCl(140mM)，KCl(1mM)，MgCl2(1mM)，CaCl2(1mM)，最终溶液的pH值为7.4。并且，配置的PBS缓冲液与超纯水均需进行高温灭菌处理。具体方法是，将PBS和超纯水分别放置在不同的锥形瓶中，然后用锡箔纸和报纸进行封口。在高压灭菌锅中120℃的温度下灭菌20min。该专利技术的检测方式是电化学检测，利用传统的三电极体系。Ag/AgCl为参比电极，铂丝为对电极，修饰的金电极为工作电极。在检测之前，先通过Au-S键将CP-SH固定到电极表面。将反应后的均相AP溶液修饰到电极表面，然后37℃孵育2h使AP打开CP-SH。再滴加HP1-HP2-HP3-HP4溶液37℃孵育2h形成分支HCR。加入[Ru(NH3)6]3+后，继续孵育10min。然后用三电极工作体系检测信号峰。电位设置为0到-0.5V，脉冲宽度0.05V，扫描速率为0.06s，采用差分脉冲伏安法读取电信号的变化，检测待测目标物。本专利技术一共用到了10条DNA链，其序列分别是：Apt-1:5’-ACCTGGGGGAGTATATAAGCACCACATCTCAT-3’Apt-2:5’-CCTTATGCTGCTTATTTGCGGAGGAAGGT-3’TP:5’-CAGTATGAGATGTGGTAGCCAGTATGAGATGTGGTAGCATAAGG-3’AP:5’-AATAGCTACCACATCTCATACTG-3’FP:5’-GCTACCACATCTCATACTGGCTACCACATCTCATACTG-3’HP1:5’-CAGTATGAGATGTGGTAGGCTTAGTTAACGTCGTCTCTACCACATCTC-3’HP2:5’-CTACCACATCTCATACTGGAGATGTGGTAGAGACGATCCATC-3’HP3:5’-TTAACGTCCATCAGTTTCGATGGACGTTAACTAAGC-3’HP4:5’-GAAACTGATGGACGTTAAGCTTAGTTAACGTCCATC-3’CP-SH:5’-SH-TTTTTCAGTATGAGATGTGGTAGGCTTAGTTAACGTCGTCTCTACCACATCTC-3’其中，Apt-1与Apt-2的单下划线部分为ATP劈开的适配体，在ATP存在时，其能够拉近Apt-1与Apt-2，使两部分双下划线序列邻近，共同进入下一步反应。TP的双下划线和单下划线部分为相同序列，可以同时与AP的单下划线部分杂交形成双链。这部分需要提前杂交好才能加入反应体系。在ATP拉近Apt-1与Apt-2后，拉近的两端可以与TP的斜体部分杂交，置换掉TP上单下划线部分杂交的AP。然后，FP能够与TP的单双下划线部分共同杂交，置换掉TP上双下划线部分的AP以及Apt-1-Apt-2-ATP部分。AP的单下划线序列能够打开HP1单下划线序列，紧接着打开的HP1的双下划线序列能够打开HP2的双下划线部分，打开的HP2单下划线部分继续打开HP1，形成第一步HCR（杂交链式反应）。而HP1与HP2两个的无下划线部分通过HCR连接在一起能够打开H本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测ATP的电化学传感器，其特征在于，在电极上依次修饰有CP‑SH层、AP层、HP1‑HP2‑HP3‑HP4层、[Ru(NH3)6]3+层；所述的AP层由均相AP溶液反应获得，原料包括Apt‑1、Apt‑2、AP‑TP杂交双链、FP以及待测目标物；所述的CP‑SH为CP的5’端修饰有巯基；所述的碱基序列如下：Apt‑1序列如SEQ No.1所示；Apt‑2序列如SEQ No.2所示；TP序列如SEQ No.3所示；AP序列如SEQ No.4所示；FP序列如SEQ No.5所示；HP1序列如SEQ No.6所示；HP2序列如SEQ No.7所示；HP3序列如SEQ No.8所示；HP4序列如SEQ No.9所示；CP‑SH序列如SEQ No.10所示。

【技术特征摘要】
1.一种检测ATP的电化学传感器，其特征在于，在电极上依次修饰有CP-SH层、AP层、HP1-HP2-HP3-HP4层、[Ru(NH3)6]3+层；所述的AP层由均相AP溶液反应获得，原料包括Apt-1、Apt-2、AP-TP杂交双链、FP以及待测目标物；所述的CP-SH为CP的5’端修饰有巯基；所述的碱基序列如下：Apt-1序列如SEQNo.1所示；Apt-2序列如SEQNo.2所示；TP序列如SEQNo.3所示；AP序列如SEQNo.4所示；FP序列如SEQNo.5所示；HP1序列如SEQNo.6所示；HP2序列如SEQNo.7所示；HP3序列如SEQNo.8所示；HP4序列如SEQNo.9所示；CP-SH序列如SEQNo.10所示。2.根据权利要求1所述的电化学传感器，其特征在于，所述HP1-HP2-HP3-HP4层中HP1、HP2、HP3、HP4的摩尔比为1：1：1：1。3.权利要求1或2所述的电化学传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）对电极进行预处理；（2）将CP-SH层修饰到电极表面；（3）将AP层修饰到电极表面；（4）将HP1-HP2-HP3-HP4层修饰到电极表面；（5）将[Ru(NH3)6]3+层修饰到电极表面；（6）电化学传感器检测ATP。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤（2）将CP-SH层修饰到电极表面的操作步骤如下：将1μMCP-SH滴加10μL到经过预处理的电极表面，在37℃下孵育2h，清洗。5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤（3）将AP层修饰到电极表面...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘素，宋晓蕾，黄加栋，王玉，张雪，王敬锋，王海旺，
申请(专利权)人：济南大学，
类型：发明
国别省市：山东,37