本发明专利技术公开了一种与不结球白菜隐性核不育系的育性基因紧密连锁的分子标记及其应用，包括6个SSR分子标记和6个IP标记，所述的分子标记可以快速鉴定出不育系转育后代群体内单株基因型，为不育系的快速选育及后期杂交制种提供便利，缩短育种年限，实现了不育系的高效选育，同时为不结球白菜隐性细胞核雄性不育相关基因的精细定位和克隆奠定基础。
【技术实现步骤摘要】
与不结球白菜隐性核不育系育性基因紧密连锁的分子标记及其应用
本专利技术属于不结球白菜分子标记辅助育种领域，具体涉及与不结球白菜隐性核不育系育性基因紧密连锁的分子标记，该标记可用于选育不结球白菜雄性不育系及精细定位不结球白菜隐性核不育系育性基因。
技术介绍
不结球白菜(Brassicacampestrisssp.ChinensisMakino)，又名小白菜、青菜、鸡毛菜，在东亚地区栽培十分广泛，是一种重要的叶菜类蔬菜。不结球白菜属十字花科芸薹属白菜亚种，是典型的异花授粉作物，杂种优势明显(邓晓辉，张蜀宁，侯喜林，陈沁滨(2007)不结球白菜pol胞质雄性不育系和其保持系的RAPD分析及分子标记筛选.南京农业大学学报30(1):19-22)。目前，利用雄性不育系制种是植物杂种优势利用的有效途径，因此对白菜雄性不育系的选育及其应用研究深受育种工作者的重视。白菜核不育两用系自20世纪70年代培育成功以来，已在生产F1代杂种中发挥了重要作用，但是在相当长一段时间对其遗传规律的认识仅停留在形态学和细胞学水平。随着分子标记技术的诞生，对白菜雄性不育的研究开始向分子水平发展。利用分子标记技术寻找与雄性不育性状相关基因连锁的标记，为分子标记辅助育种打下良好的基础。将与育性基因连锁的分子标记应用于辅助相应白菜雄性不育系的选育(王丽丽，魏鹏，刘志勇，李承彧，王玉刚，冀瑞琴，冯辉(2011).利用分子标记辅助选育大白菜核基因雄性不育系.分子植物育种(网络版)9:1382-1388)，极大降低了选育群体的数量，缩短了选育年限，实现了不育系的高效选育。但针对小白菜隐性核不育材料的分子标记开发鲜有报道。随着模式植物拟南芥及芸薹属植物白菜、甘蓝、甘蓝型油菜和芥菜型油菜基因组的测序完成，基于比较基因组和参考基因组序列进行分子标记的开发和物理图谱的构建是目前芸薹属植物基因精细定位和染色体登陆中最常用的手段。基于拟南芥和芸薹属基因组序列的共线性、编码区序列的相似性及内含子多态性，开发IP标记已成为芸薹属植物中缩小定位区段的重要手段(DunXL,ZhouZF,XiaSQ,WenJ,YiB,ShenJX,MaCZ,TuJX,FuTD(2011)BnaC.Tic40,aplastidinnermembranetransloconoriginatingfromBrassicaoleracea,isessentialfortapetalfunctionandmicrosporedevelopmentinBrassicanapus.PlantJournal68(3):532-545.；XiaSQ,ChengL,ZuF,DunXL,ZhouZF,YiB,WenJ,MaCZ,ShenJX,TuJX(2012)MappingofBnMs4andBnRftoacommonmicrosyntenicregionofArabidopsisthalianachromosome3usingintronpolymorphismmarkers.TheorApplGenet,124:1193-1200.；HuangZ,LiuL,LuH,LangLN,ZhaoN,DingJ,XuAX(2016)DevelopmentofIPandSCARmarkerslinkedtotheyellowseedcolorgeneinBrassicajunceaL.BreedSci,66:175-180.)。利用定位区段在自身基因组上的物理位置或者其他物种中同源区段的序列信息开发SSR、SCAR、IP分子标记，可加快目标基因的定位，而且定位区段的物理位置也变为已知，构建遗传图谱的同时也是构建目标基因的物理图谱，可省去构建、筛选DNA文库及染色体登陆的大量工作。另外利用参考基因组上定位区间的基因注释信息可进行候选基因的预测，加快基因的克隆(CaiGQ,YangQY,YiB,FanCC,EdwardsD,BatleyJ,ZhouYM(2014)AComplexRecombinationPatternintheGenomeofAllotetraploidBrassicanapusasRevealedbyaHigh-DensityGeneticMap.PLoSOne9:e109910.)。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种与不结球白菜隐性核不育系育性基因紧密连锁的分子标记，包括6个SSR分子标记和6个IP标记，可用于精细定位育性基因，也可利用分子标记进行不育系的辅助育种，降低了选育群体的数量，缩短了选育年限，实现了不育系的高效选育。为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术措施：与不结球白菜隐性核不育系育性基因紧密连锁的分子标记的筛选方法，包括以下步骤：A、以矮脚黄A(WS24-3)×贺B矮(WS135)的F1自交得到的F2育性分离群体及矮脚黄A为轮回亲本构建BC1和BC2回交群体；B、各单株编号挂牌，选取30个不育单株和30个可育单株，提取样品DNA，每10份单株样品DNA等量混合，分别混合得到三个不育集团池和三个可育集团池；将之前初步定位得到的350k区段序列与白菜基因组A2染色体进行比对分析，获得的相应基因组区段序列，在线设计155对SSR引物和174对IP引物，不育单株和可育单株三对三混池筛选标记，并进行群体验证筛选，分别得到6个SSR差异标记和6个IP差异标记，分别为：SSR81-2，SSR82-8，SSR85-3，SSR86-6，SSR89-2，SSR883，IP5，IP8，IP10，IP18，IP25，IP29；C、将上述6个SSR标记和6个IP标记进行BC1代3520个单株和BC2代2612个单株的分离大群体验证。基于孟德尔和摩尔根遗传连锁和分离规律，将6个SSR标记和6个IP标记的BC1代和BC2代群体单株基因型数据以及单株育性性状统计数据，运行MAPMAKER/EXPVersion3.0软件分析，确定其遗传距离。结果表明:标记SSR883和IP25与目标基因遗传距离最近，均为0.1cM。通过上述三个步骤的实施，筛选得到12个有差异的分子标记，其中SSR标记有6个，IP标记有6个，这12个分子标记不仅适用于回交BC1群体交换单株的筛选，同样也适用于BC2群体交换单株的筛选，其多态性并没有丧失，而且将之前初步定位得到的350K区段直接缩短到128K的物理距离内，大大缩小了目标基因的范围，提高了候选基因预测的准确性，加快基因的克隆。本专利技术与现有技术相比，具有以下优点和效果：1.利用将与育性基因连锁的SSR标记和IP标记辅助相应不结球白菜雄性不育系的选育极大降低了选育群体的数量，缩短了选育年限，实现了不育系的高效选育。2.利用参考基因组上定位区间的基因注释信息可进行候选基因的预测，结合细胞学观察，更准确地确定候选基因，加快基因的克隆。3.获得的SSR分子标记和IP标记可以快速鉴定出不育系转育后代群体内单株基因型，为不育系的快速选育及后期杂交制种提供便利。附图说明图1为SSR和IP标记在可育和不育混合池的电泳图。图中：A表示不育集团混合池，B表示可育集团混合池。图2为Bra2Ms的连锁图与白菜基因组A2染色体对应区段示意图。图3为可育材料与不育材料花粉发育半薄切片图。A-E表示可育材料本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.与不结球白菜隐性核不育系的育性基因紧密连锁的分子标记，其特征在于，包括6个SSR分子标记和6个IP标记，所述分子标记及其扩增引物如下：
【技术特征摘要】
1.与不结球白菜隐性核不育系的育性基因紧密连锁的分子标记，其特征在于，包括6个SSR分子标记和6个IP标记，所述分子标记及其扩增引物如下：。2...
【专利技术属性】
技术研发人员：宋莉萍，汪爱华，周国林，李霞，高长斌，林处发，王斌才，
申请(专利权)人：武汉市农业科学院，
类型：发明
国别省市：湖北,42
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