一种肉牛肌肉细胞氧化损伤模型构建方法及应用技术

本发明专利技术提供了一种肉牛肌肉细胞氧化损伤模型构建方法及应用，属于细胞生物学技术领域。其技术方案为：一种肉牛肌肉细胞氧化损伤模型构建方法，包括以下步骤：配制细胞培养液、分离肉牛肌肉组织、培养肉牛肌肉细胞和氧化损伤模型构建参数的获取。本发明专利技术的有益效果为：本发明专利技术以分离的肉牛肌肉细胞为研究对象，采用过氧化氢建立肉牛肌肉细胞氧化损伤模型，为牛肉品质的降低和营养调控机理研究提供材料，减少后续试验的研发成本；建立的肉牛肌肉细胞氧化损伤模型可为牛肉品质的调控机理研究及饲料抗氧化活性物质的开发提供机理研究材料，直接应用本模型大大缩短了研发成本和时间。

【技术实现步骤摘要】
一种肉牛肌肉细胞氧化损伤模型构建方法及应用
本专利技术涉及细胞生物学及
，尤其涉及一种肉牛肌肉细胞氧化损伤模型构建方法及应用。
技术介绍
随着人们生活水平的提高，牛肉已进入千家万户，但品质千差万别。归因于肉牛在饲养、屠宰等过程中，因管理、运输不当引起的应激而导致的牛肉品质降低。目前，该问题已引起广泛关注，但多数研究还仅仅停留在生产水平。此外，很多学者专家拟在肉牛饲料中添加抗氧化活性物质，从而提高牛肉品质，但由于缺乏分子细胞层面的机理研究，导致添加剂量盲目，且饲喂的负面效果难以预测。目前，国内关于肉牛肌肉细胞的氧化损伤模型还未建立。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种肉牛肌肉细胞氧化损伤模型构建方法及应用。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供了一种肉牛肌肉细胞氧化损伤模型构建方法，包括以下步骤：步骤一：配制细胞培养液：将50-60份(体积份数)胎牛血清(FBS)、2-3份(体积份数)青链霉素混合液溶解在450-500份(体积份数)细胞培养液中，经过0.22微米滤膜过滤后分装到灭菌的离心管中，每管40-45毫升，放置4℃保存，细胞培养前0.5-1小时将培养液放在37℃水浴锅中预热，得细胞培养液；步骤二：分离肉牛肌肉组织：剪取成年肉牛腹侧肌肉组织10g-20g，用无菌生理盐水冲洗2-3遍，迅速放在100mL含1-2％青链霉素液的磷酸盐缓冲液(PBS)的样品瓶中，封口膜封口后低温运输，在1-2小时内带回实验室；在无菌超净台内将肌肉组织从样品瓶中取出后放在无菌平皿中，利用体式显微镜剔除筋膜及多余脂肪组织，再用PBS冲洗3-5遍，之后用眼科剪刀将肌肉组织剪碎至乳糜状；步骤三：培养肉牛肌肉细胞：用吸管吸取乳糜组织均匀放在培养瓶底壁，然后翻转培养瓶加入配制好的细胞培养液，将培养瓶平放入培养箱中，30-40分钟后翻转培养瓶，让培养液慢慢浸没培养瓶底壁的乳糜组织，并重新将培养瓶放回培养箱继续培养38-48小时后细胞贴壁生长，5-6天后有80％-90％细胞贴壁；得到肌肉细胞；步骤四：氧化损伤模型构建参数的获取：将分离得到的贴壁肌肉细胞消化后制备细胞悬着液，调整细胞悬着液的细胞浓度为5×104个/mL的，将细胞悬着液接种于96孔板中，在培养箱中培养24小时，然后更换为H2O2(0，50，100，150，200，250，300，350，400，450μM)培养液处理24小时，利用CellCountingKit-8试剂盒检测细胞存活率，当H2O2升至300μM时，细胞存活率降至60％左右，继续提高浓度细胞发生大量死亡；另将5×104个/mL的细胞悬着液接种于25cm2培养瓶中，待细胞汇合至80％时，更换为H2O2(0，50，100，150，200，250，300，350，400，450μM)培养液处理24小时，收集细胞，检测超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、丙二醛(MDA)、蛋白质羰基(PC)和8-羟基脱氧鸟苷(8-OHG)，发现SDO和CAT活性先升高后降低，MDA、PC和8-OHG逐渐升高；得出300μMH2O2为氧化损伤模型的有效作用浓度。基于上述结果，采用300μMH2O2对肉牛肌肉细胞处理45min、1.5h、3h、6h、12h、24h，测定细胞存活率、SOD、CAT、MDA、PC和8-OHG，发现随着处理时间的延长，细胞存活率逐渐降低，处理6小时存活率降至61.2％，SOD和CAT活性先升高后降低，MDA、PC和8-OHG均逐渐升高。综合各项指标，得出300μMH2O2作用时间为6h为宜。步骤一中所述细胞培养液为(DMEM/F12)。步骤四中所述细胞悬着液的调整细胞浓度为5×104个/mL。步骤四中得出的氧化损伤模型的有效作用浓度300μMH2O2，用300μMH2O2对肉牛肌肉细胞处理45min、1.5h、3h、6h、12h、24h，测定细胞存活率、SOD、CAT、MDA、PC和8-OHG，随着处理时间的延长，细胞存活率逐渐降低，处理6小时存活率降至61.2％，SOD和CAT活性先升高后降低，MDA、PC和8-OHG均逐渐升高。步骤四中所述肉牛肌肉细胞氧化损伤模型建立的适宜参数为300μMH2O2处理时间为6h。所述分离得到的贴壁肌肉细胞利用本模型参数建立氧化损伤模型，在模型基础上可以研究不同产品对肉牛氧化损伤的调控效果，这个模型就是为新产品的开发提供铺垫。将得到的肉牛肌肉细胞氧化损伤模型用于牛肉品质调控产品的开发提供机理研究素材。所述离体肉牛肌肉细胞，过氧化氢(H2O2，Sigma公司，323381)，DMEM/F12(Gibco公司，8117245)、胎牛血清(BI公司，04-001-1A)、青链霉素混合液(北京索莱宝科技有限公司，P1400)、胰酶(Gibco公司，25200072)，CellCountingKit-8(CCK-8，MCE公司)，抗氧化酶试剂盒，超氧化物歧化酶(SOD，abcam公司，ab65354)、过氧化氢酶(CAT，abcam公司，ab83464)，氧化产物试剂盒：丙二醛(MDA，江苏凯基生物技术股份有限公司，KGT004-1)、蛋白质羰基(PC，北京索莱宝科技有限公司，BC1275)、8-羟基脱氧鸟苷Elisa试剂盒(8-OHG，Cayman公司，589320)；培养箱(Thermo公司，型号371)，超净台(苏净安泰，型号SW-CJ-2F)。为了更好的实现上述专利技术目的，本专利技术还提供了肉牛肌肉细胞氧化损伤模型的试验方法及测定指标：(1)、不同浓度H2O2对肉牛肌肉细胞增殖及氧化还原状态的影响：在超净台内，用基础培养液制备细胞悬着液，调整细胞浓度为5×104个/mL。细胞增殖情况检测：将细胞悬着液接种于96孔板(100μL/孔)，在培养箱中培养24h，然后更换为H2O2(0，50，100，150，200，250，300，350，400，450μM)培养液，每个时间点设6个重复，处理24h后更换为基础培养液，在每孔中各加入10μL的CCK-8溶液，将培养板置于37℃培养箱内孵育1-4h，用酶标仪测定450nm处的吸光度。细胞形态及氧化还原状态检测：将细胞悬着液接种于25cm2培养瓶，待细胞汇合至80％时，更换为H2O2(0，50，100，150，200，250，300，350，400，450μM)培养液，每个时间点设6个重复，将培养板置于37℃培养箱内处理24h后，光镜观察细胞形态，然后收集各组细胞，测定抗氧化酶(SOD、CAT)、氧化产物(MDA、PC、8-OHG)。表1不同浓度H2O2对肉牛肌肉细胞抗氧化酶活性的影响：注：同行数据肩标无字母或有相同字母表示差异不显著(P>0.05)，不同字母表示差异显著(P<0.05)。下表同。(2)H2O2不同处理时间对肉牛肌肉细胞增殖及氧化还原状态的影响：表2不同浓度H2O2对肉牛肌肉细胞氧化产物含量的影响：根据上述确定的H2O2的有效作用浓度，对肉牛肌肉细胞处理45min、1.5h、3h、6h、12h、24h，收集细胞测定细胞增殖和氧化还原状态，测定方法和指标同(1)中所示，以确定H2O2的有效作用时间。(3)不同浓度H2O2对肉牛肌肉细胞形态、增殖及氧化损伤的影响：图1结果显示，随着H2O2浓度由0μM提高本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种肉牛肌肉细胞氧化损伤模型构建方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一：配制细胞培养液：将50‑60份（体积份数）胎牛血清（FBS）、2‑3份（体积份数）青链霉素混合液溶解在450‑500份（体积份数）细胞培养液中，经过0.22微米滤膜过滤后分装到灭菌的离心管中，每管40‑45毫升，放置4℃保存，细胞培养前0.5‑1小时将培养液放在37℃水浴锅中预热，得细胞培养液；步骤二：分离肉牛肌肉组织：剪取成年肉牛腹侧肌肉组织10g‑20g，用无菌生理盐水冲洗2‑3遍，迅速放在100mL含1‑2%青链霉素液的磷酸盐缓冲液（PBS）的样品瓶中，封口膜封口后低温运输，在1‑2小时内带回实验室；在无菌超净台内将肌肉组织从样品瓶中取出后放在无菌平皿中，利用体式显微镜剔除筋膜及多余脂肪组织，再用PBS冲洗3‑5遍，之后用眼科剪刀将肌肉组织剪碎至乳糜状；步骤三：培养肉牛肌肉细胞：用吸管吸取乳糜组织均匀放在培养瓶底壁，然后翻转培养瓶加入配制好的细胞培养液，将培养瓶平放入培养箱中，30‑40分钟后翻转培养瓶，让培养液慢慢浸没培养瓶底壁的乳糜组织，并重新将培养瓶放回培养箱继续培养38‑48小时后细胞贴壁生长，5‑6天后有80%‑90%细胞贴壁；得到肌肉细胞：步骤四：氧化损伤模型构建参数的获取：将分离得到的贴壁肌肉细胞消化后制备细胞悬着液，调整细胞悬着液的细胞浓度为5×104个/mL，将细胞悬着液接种于96孔板中，在培养箱中培养24小时，然后更换为H2O2（0，50，100，150，200，250，300，350，400，450μM）培养液处理24小时，利用Cell Counting Kit‑8试剂盒检测细胞存活率，当H2O2升至300μM时，细胞存活率降至60%左右，继续提高浓度细胞发生大量死亡；另将5×104个/mL的细胞悬着液接种于25 cm2培养瓶中，待细胞汇合至80%时，更换为H2O2（0，50，100，150，200，250，300，350，400，450μM）培养液处理24小时，收集细胞，检测超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、丙二醛（MDA）、蛋白质羰基（PC）和8‑羟基脱氧鸟苷（8‑OHG），发现SDO和CAT活性先升高后降低，MDA、PC和8‑OHG逐渐升高；得出300μM H2O2为氧化损伤模型的有效作用浓度。...

【技术特征摘要】
1.一种肉牛肌肉细胞氧化损伤模型构建方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一：配制细胞培养液：将50-60份（体积份数）胎牛血清（FBS）、2-3份（体积份数）青链霉素混合液溶解在450-500份（体积份数）细胞培养液中，经过0.22微米滤膜过滤后分装到灭菌的离心管中，每管40-45毫升，放置4℃保存，细胞培养前0.5-1小时将培养液放在37℃水浴锅中预热，得细胞培养液；步骤二：分离肉牛肌肉组织：剪取成年肉牛腹侧肌肉组织10g-20g，用无菌生理盐水冲洗2-3遍，迅速放在100mL含1-2%青链霉素液的磷酸盐缓冲液（PBS）的样品瓶中，封口膜封口后低温运输，在1-2小时内带回实验室；在无菌超净台内将肌肉组织从样品瓶中取出后放在无菌平皿中，利用体式显微镜剔除筋膜及多余脂肪组织，再用PBS冲洗3-5遍，之后用眼科剪刀将肌肉组织剪碎至乳糜状；步骤三：培养肉牛肌肉细胞：用吸管吸取乳糜组织均匀放在培养瓶底壁，然后翻转培养瓶加入配制好的细胞培养液，将培养瓶平放入培养箱中，30-40分钟后翻转培养瓶，让培养液慢慢浸没培养瓶底壁的乳糜组织，并重新将培养瓶放回培养箱继续培养38-48小时后细胞贴壁生长，5-6天后有80%-90%细胞贴壁；得到肌肉细胞：步骤四：氧化损伤模型构建参数的获取：将分离得到的贴壁肌肉细胞消化后制备细胞悬着液，调整细胞悬着液的细胞浓度为5×104个/mL，将细胞悬着液接种于96孔板中，在培养箱中培养24小时，然后更换为H2O2（0，50，100，150，200，250，300，350，400，450μM）培养液处理24小时，利用CellCountingKit-8试剂盒检测细胞存活率，当H2O2升至300μM时，细胞存活率降至60%左右，继续提高浓度细胞发生大量死亡；另将5×104个/mL的细胞悬着液接种于25cm2培养瓶中，待细胞汇合至80%时，更换为H2O2（0，50，100，150，200，250，300，350，400，4...

【专利技术属性】
技术研发人员：张相伦，游伟，靳青，谭秀文，刘桂芬，赵红波，魏晨，刘晓牧，万发春，刘倚帆，
申请(专利权)人：山东省农业科学院畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：山东,37