一种用于预防龋齿的卵黄抗体及其制备方法和卵黄抗体制剂技术

本发明专利技术公开了一种用于预防龋齿的卵黄抗体及其制备方法和卵黄抗体制剂，所述制备方法为，采用变异链球菌免疫原免疫母鸡后，收集免疫后的所述母鸡的鸡蛋并提取卵黄抗体；所述变异链球菌免疫原包括变异链球菌的破碎蛋白溶出物。本发明专利技术提供的制备方法通过采用变异链球菌的破碎蛋白溶出物免疫母鸡，最终制得的卵黄抗体特异性强，卵黄抗体效价高，能够用于制备抗龋齿制剂，特别是牙膏和漱口水能够有效抑制细菌生物膜的形成，抑制细菌生长，表现出优异的抗龋齿效果，而且，这种抗体对动物损害小，安全可靠；无毒副作用，不会产生耐药性，无有毒物质残留；易于控制规模化生产，生产成本低。

【技术实现步骤摘要】
一种用于预防龋齿的卵黄抗体及其制备方法和卵黄抗体制剂
本专利技术涉及生物
，更具体地，涉及一种用于预防龋齿的卵黄抗体及其制备方法和卵黄抗体制剂。
技术介绍
龋齿，世界卫生组织认定的三大重点防治疾病之一，发病率高，分布范围广，患者常因青少年时龋齿引发的牙痛而不能充分咀嚼食物，妨碍正常的消化与吸收，从而导致生长发育方面的疾病或其他疾病。目前龋齿只能靠牙科填充手段进行治疗，不能自愈。罹患龋齿后，牙痛会影响食欲，干扰患者正常的咀嚼，进而影响食物的消化和吸收，出现缺乏营养的状况。龋齿的进一步发展，会引起颜面蜂窝织炎、牙髓炎、齿槽逸脓、根周脓肿等口腔疾病，危害青少年的颌面发育。目前有研究表明，龋病主要是由变异链球菌(Streptococcusmutans，sm)引起的具有传染性的疾病，是人类最常见的疾病之。变异链球菌通过黏附在牙齿表面，形成口腔生物膜，即牙菌斑。同时，变异链球菌代谢产生以乳酸为主的酸性副产物导致局部pH值下降引起牙釉质层脱矿，最终形成龋洞，影响人类健康。卵黄免疫球蛋白，又称为卵黄抗体。是从血液中的抗体，富集到鸡蛋蛋黄中的一种活性抗体，在抗菌和抗病毒方面具有优良的特性。引起来国内外学者的广泛研究。有研究表明，特异性卵黄抗体能够为人或者动物提供有效的被动免疫。应用细菌疫苗免疫产蛋鸡可获得抗变异链球菌的特异性IgY抗体，口服特异性IgY可阻止变异链球菌黏附于牙齿表面，干扰牙菌斑的形成，发挥抑龋作用，并且这一种抗体，具有安全性强，无毒副作用和生产成本低等优点。但是，现有的卵黄抗体对变异链球菌的特异性仍不够强，需要开发出特异性强的卵黄抗体。另外，还需要开发出能够预防龋齿的制剂。
技术实现思路
本专利技术为克服上述现有技术所述的缺陷，提供一种用于预防龋齿的卵黄抗体的制备方法，所述方法制得的卵黄抗体对变异链球菌的特异性强，卵黄抗体效价高，可用于预防龋齿，无毒副作用，安全可靠，且易于规模化生产，生产成本低。为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案是：一种用于预防龋齿的卵黄抗体的制备方法，所述制备方法采用变异链球菌免疫原免疫母鸡后，收集免疫后的所述母鸡的鸡蛋并提取卵黄抗体；所述变异链球菌免疫原包括变异链球菌的破碎蛋白溶出物。本专利技术中用于免疫母鸡的变异链球菌免疫原不同于普通的甲醛灭活的变异链球菌，而是采用超声破碎的变异链球菌，还可以复合甲醛灭活的变异链球菌，从而得到本专利技术中使用的变异链球菌免疫原。采用含有破碎蛋白溶出物的变异链球菌免疫原免疫母鸡，最终提取的卵黄抗体特异性更强，卵黄抗体效价高，能够用于制备抗龋齿制剂，特别是牙膏和漱口水，表现出优异的抗龋齿效果，能够抑制变异链球菌口腔生物被膜的形成。而且，无毒副作用，安全可靠，且易于规模化生产，生产成本低。专利技术人研究了该卵黄抗体的特异性，测试了该卵黄抗体对其他细菌的交叉反应率。研究结果显示，牙龈卟啉单胞菌、伴放线杆菌、Solobacteriummoorei细菌、幽门螺杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、屎肠球菌、鼠伤寒沙门杆菌、枯草芽孢杆菌、白色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、铜绿假单胞菌、单核球增多性李斯特菌、副溶血性弧菌、嗜水气单胞菌、珊瑚色诺卡氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、荧光假单胞菌交叉反应率低，交叉反应率在0.39%~0.78%之间。所述变异链球菌为ATCC25175。变异链球菌ATCC25175可通过普通市售得到。优选地，所述破碎蛋白溶出物由变异链球菌菌液经超声破碎处理后，与变异链球菌混合，再与佐剂混合并充分乳化得到。所述佐剂包括完全佐剂和不完全佐剂。所述变异链球菌免疫原也称为疫苗。优选地，所述免疫包括初次免疫和加强免疫。初次免疫为弗氏完全佐剂疫苗。加强免疫为弗氏不完全佐剂疫苗；加强免疫的次数可以为5次。免疫操作为，鸡胸二点和鸡翅皮下二点注射，每点注射0.3mL。优选地，提取卵黄抗体的步骤包括，将鸡蛋的蛋黄经聚乙二醇或水提取后，再经聚乙二醇、硫酸铵或硫酸钠盐析分离提纯得到所述卵黄抗体。优选地，提取卵黄抗体的步骤包括，将鸡蛋的蛋黄经聚乙二醇提取后，再先后经聚乙二醇和硫酸铵溶液提纯，得到所述卵黄抗体。提取卵黄抗体的具体步骤：将获得的免疫鸡蛋消毒后破壳去膜收集蛋黄，加入蛋黄3倍体积的含有3.5%PEG6000的PBS缓冲液（含有3.5%PEG6000的磷酸盐缓冲溶液是指，3.5gPEG6000加入到100mL的PBS溶液中，即二者质量体积比为3.5%g/mL），混匀，调节pH为7.4，搅拌30～40min后，静置12～15h；10000rpm，4℃，20min离心，取上清液，过滤，得到滤液。滤液中缓慢加入PEG6000；PEG6000的质量与滤液的体积之比为12%g/mL；调pH7.4，搅拌30～40min；离心，弃上清得沉淀，即为卵黄抗体粗品。将卵黄抗体粗品用PBS缓冲液溶解后，离心，取上清液，慢慢滴入与上清液等体积的饱和硫酸铵溶液，然后2～4℃静置12～15h；离心，得到沉淀，沉淀用PBS溶液溶解，含有PBS溶液一半体积的饱和硫酸铵溶液混匀，2～4℃静置1～2h；离心，得到沉淀物，沉淀物用PBS溶液溶解后透析，真空冷冻干燥，得到抗变异链球菌卵黄抗体提纯物。提取卵黄抗体还可以采用另一种方法：将鸡蛋的蛋黄经水提取后，再先后经过硫酸铵溶液和硫酸钠溶液提纯，得到所述卵黄抗体。上述方法具体如下：将获得的免疫鸡蛋消毒后破壳去膜收集卵黄液，加入9倍卵黄液体积的pH为5的水稀释，搅拌30min，搅匀后4℃过夜；在10000r/min、4℃条件下离心15min，收集上清液然后将上清液用滤纸过滤，即为水溶性组分。滤液中加入缓慢加入饱和硫酸铵溶液使其浓度达到50%的饱和度，边加入边搅拌，停止加入后继续搅拌10min后4℃静置2h；将提取液在8000rpm，4℃条件下离心20min后，收集沉淀。将卵黄抗体粗品用卵黄液体积的PBS缓冲液溶解后，加入6倍卵黄液体积的19%硫酸钠溶液（19%硫酸钠溶液是指，19g硫酸钠溶于100mL的水溶液中，即二者质量体积比为19%g/mL），混匀，室温静置过夜；在8000rpm，4℃条件下离心20min后，收集沉淀；沉淀物用PBS溶液溶解后透析，真空冷冻干燥，得到抗变异链球菌卵黄抗体提纯物。本专利技术还保护上述制备方法制得的卵黄抗体。上述卵黄抗体在制备抗龋齿制剂中的应用也在本专利技术的保护范围之内。本专利技术还保护一种用于预防龋齿致病菌的卵黄抗体制剂，所述卵黄抗体制剂包括如下重量百分含量的组分：卵黄抗体0.01%~5%，辅料95%~99.99%。优选地，所述卵黄抗体制剂为卵黄抗体牙膏，所述卵黄抗体牙膏包括如下重量百分含量的组分：卵黄抗体0.01%~5%；葡萄糖酸氯己定溶液0.01%~0.2%，甘油1.0%~15.0%，聚乙烯吡咯烷酮0.1%~2.0％；余量为牙膏膏基。一般地，牙膏膏基的成分为：磷酸氢钙、山梨糖醇、水合硅石、去离子水、月桂醇硫酸酯钠、聚乙二醇、香精、纤维素胶、薄荷脑、黄原胶、糖精钠、植酸钠、冰片、硅酸钠、DMDM乙内酰脲、氨甲环酸、羟苯甲酯、焦磷酸四钠、硼砂等。优选地，所述卵黄抗体制剂为卵黄抗体漱口水，所述卵黄抗体漱口水包括如下重量百分含量的组分：卵黄抗体0.1%~2%，甘露醇5.0%，甘油1.0%~15.0%，葡萄糖酸氯己定溶液0.01%~0.2%，余量为本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于预防龋齿的卵黄抗体的制备方法，其特征在于，采用变异链球菌免疫原免疫母鸡后，收集免疫后的所述母鸡的鸡蛋并提取卵黄抗体；所述变异链球菌免疫原包括变异链球菌的破碎蛋白溶出物。

【技术特征摘要】
1.一种用于预防龋齿的卵黄抗体的制备方法，其特征在于，采用变异链球菌免疫原免疫母鸡后，收集免疫后的所述母鸡的鸡蛋并提取卵黄抗体；所述变异链球菌免疫原包括变异链球菌的破碎蛋白溶出物。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述破碎蛋白溶出物由变异链球菌菌液经超声破碎处理后，与变异链球菌混合，再与佐剂混合并充分乳化得到。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，提取卵黄抗体的步骤包括，将鸡蛋的蛋黄经聚乙二醇或水提取后，再经聚乙二醇、硫酸铵或硫酸钠盐析分离提纯得到所述卵黄抗体。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，提取卵黄抗体的步骤包括，将鸡蛋的蛋黄经聚乙二醇提取后，再先后经聚乙二醇和硫酸铵溶液提纯，得到所述卵黄抗体。5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，提取卵黄抗体的步骤包括，将鸡蛋的蛋黄经水提取后，再先后经过硫酸铵溶液和硫酸钠溶液提纯，得到...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵肃清，贺攀，卢明磊，杨慧怡，王甜甜，
申请(专利权)人：广东工业大学，
类型：发明
国别省市：广东,44