一种新型鹅星状病毒卵黄抗体的制备及其应用制造技术

本发明专利技术提供一种使用新型鹅星状病毒制备的卵黄抗体，本发明专利技术的卵黄抗体，是用保藏编号为CCTCC No：V201820的新型鹅星状病毒GD 0122株制备的灭活疫苗作为抗原制备的。本发明专利技术所制备的抗体，安全性良好，接种雏鹅后，未出现因注射抗体引起的任何局部和全身不良反应。采用抗体效价测定和攻毒保护试验对制备的抗体进行评价，结果显示：本发明专利技术中制备的抗体琼扩抗体效价均不低于1：16，注射抗体后雏鹅能够抵御强毒的攻击，说明本发明专利技术制备的抗体对鹅群能够提供有效的免疫保护，具有很好的商品化开发前景。

【技术实现步骤摘要】
一种新型鹅星状病毒卵黄抗体的制备及其应用
本专利技术属于免疫制品
，具体涉及一种使用新型鹅星状病毒制备的卵黄抗体。技术背景痛风亦称尿酸盐沉积，肾病综合征，是由于体内尿酸产生过多或排泄障碍，造成体内大量尿酸蓄积，并以尿酸盐的形式沉积在关节、内脏器官浆膜面及其他组织间质，从而引起患禽运动迟缓、排白色稀粪、厌食、衰竭，甚至死亡，是特殊种类的蛋白质代谢紊乱性疾病。当前鹅痛风主要发生在雏鹅，5～15日龄多发，有时可见1日龄雏鹅发病，多种品种鹅均可发病，死亡率在30％～70％，发病前2～3天病鹅排石灰样稀便，脱水变瘦，然后大群出现精神沉郁、减料、干脚、脱水、呼吸困难等症状。剖检可见心包由白色尿酸盐包被，俗称“绒毛心”，肝脏、气囊浆膜面及关节处均有白色尿酸盐沉积，肾脏肿大、斑驳，输尿管扩张并有尿酸盐沉积。引起雏鹅痛风的诱因很多，通常认为与饲料蛋白含量过高、肾功能不全、引种、饲养管理不当等有关，但最近研究发现排除这些因素后，还是会发生痛风，将病死鹅剖检脏器进行触片染色，经革兰氏染色和瑞氏染色后镜下观察未发现细菌。刮取肠内容物，生理盐水涂片，置低倍镜下观察，未见球虫卵囊。取气囊及关节处石灰样物做涂片，置低倍镜下观察，可见大量针尖大小的尿酸盐结晶物。根据养殖户描述、临床症状、剖检病变，初步诊断为疑似鹅病毒性感染引发破坏肝肾功能，导致尿酸盐沉积。通过对雏鹅痛风的流行病学调查，发现该病在我国鹅群中发病率呈日益上升趋势。基于目前，国内外没有预防和治疗该病的商品化疫苗(或抗体)，该病还在不断蔓延。研制安全有效的疫苗及预防和治疗用卵黄抗体迫在眉睫，必须通过创新技术克服这一问题。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种使用新型鹅星状病毒制备的卵黄抗体，制备的卵黄抗体能有效的预防雏鹅痛风，从而弥补现有技术的不足。本专利技术的卵黄抗体，是用保藏编号为CCTCCNo：V201820的新型鹅星状病毒GD0122株制备的灭活疫苗作为抗原制备的；其中新型鹅星状病毒GD0122株，于2018年5月13日保藏在武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNo：V201820。本专利技术的卵黄抗体，其一种具体的制备方法如下：1)对产蛋鸡进行免疫用GD0122株制备的灭活疫苗进行免疫；具体如下：基础免疫每只鸡胸部肌肉注射疫苗0.5ml；二次免疫在基础免疫后14日进行第2次接种，每只鸡胸部肌肉注射1.0ml；三次免疫在二次免疫后14日进行第3次接种，每只鸡胸部肌肉注射1.0ml；维持免疫：当卵黄中鹅星状病毒琼扩抗体效价1:96时，维持接种1次，每只鸡胸部肌肉注射疫苗1.0ml；收蛋：三次强化免疫后10日，抽样取蛋，分离卵黄，提取抗体，鹅星状病毒琼扩抗体效价≥1:64为合格，收集高免鸡蛋。2)抗体制造收集蛋黄将蛋黄液加入巴氏灭菌罐中，加入适量的注射用水，搅拌混匀后，加热至65℃，保温灭活15分钟，灭活结束后，水浴冷却至30℃以下；于酸化反应罐中加入相当于原蛋黄体积4倍的注射用水，用1mol/LHCL溶液调节pH值至4.2，并将水温降至2～4℃，然后将灭活I的蛋黄液加入，边加边搅拌，4～8℃保温静置4小时；将酸化萃取液冷冻离心，去沉淀，取上清液备用；加入辛酸至终浓度0.02％，搅拌混匀，室温放置4小时；用K型多层板框过滤澄清；按终浓度0.05％加入甲醛溶液，充分搅拌混匀，密封60分钟；用截留分子量为1000KD的超滤膜过滤除病毒；加入吐温-80至终浓度0.02％，用1mol/L氢氧化钠溶液调节pH值6.8；将调配合格的抗体用0.22um微孔滤膜进行过滤除菌，无菌分装，100ml/瓶，即为雏鹅痛风精致卵黄抗体。本专利技术所提供的抗体用于预防和治疗雏鹅痛风。本专利技术所制备的抗体，安全性良好，接种雏鹅后，未出现因注射抗体引起的任何局部和全身不良反应。采用抗体效价测定和攻毒保护试验对制备的抗体进行评价，结果显示：本专利技术中制备的抗体琼扩抗体效价均不低于1：16，注射抗体后雏鹅能够抵御强毒的攻击，说明本专利技术制备的抗体对鹅群能够提供有效的免疫保护，具有很好的商品化开发前景。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术进行详细的描述。实施例1GD0122株的分离与鉴定1、流行病学调查自2017年10月份以来，广东、四川、湖北等地区的雏鹅出现了一种死亡率较高、痛风症状明显的传染性疾病。该病多发于5～15日龄雏鹅，各种品种鹅均易感，对病死的雏鹅进行剖检，主要的病理变化如下：心包增厚，有白色结晶物附着或包被，俗称“绒毛心”，肝脏被尿酸盐覆盖，输尿管变粗、代谢受阻，肾脏红肿或苍白肿大、花斑肾，直肠末端内容物白色稀粪积聚，脾脏肿大，肠壁变薄，严重的病例可见关节红肿、关节腔内有尿酸盐沉积。专利技术人从广东、四川等地采集发病鹅的病料进行实验室检测及病原分离鉴定，初步诊断为新型鹅星状病毒。最后成功从广东某鹅场的10日龄发病鹅群中分离出一株病毒。2、病毒分离选取发病症状典型的病死鹅肝脏、脾脏、肾脏，胰腺等组织50～100g，用研钵研磨组织，按1∶5(w/v)比例加含双抗(含1000U青霉素/ml+1000ug链霉素/ml)的无菌PBS(0.1mol/L，pH值7.2)匀浆，反复冻融3次后6000r/min离心10分钟，取上清液经0.22um滤器过滤除菌，无菌检验合格后保存备用。将病毒过滤液接种12～13日龄鹅胚，每胚0.2ml，36～37℃孵育，每日照胚2次，弃去24小时内死亡的鹅胚，收获24～168小时死亡鹅胚和168小时存活鹅胚尿囊液，置2～8℃冷却12～24小时，收获鹅胚尿囊液。3、病毒的鉴定3.1血凝性鉴定分别无菌采集SPF鸡和鹅血液5ml，按照2015版《中国兽药典》方法分别制备成0.8％、1％和2％浓度的红细胞悬液，4℃保存备用。将收获的鹅胚病毒液进行HA效价测定，检测分离毒株是否具有凝集这些红细胞的特性。结果：分离毒不能凝集SPF鸡和鹅红细胞，即使改变红细胞悬液的浓度，也不能使之凝集，红细胞对照成立。3.2理化特性检验病毒液分别经氯仿、乙醚、盐酸(pH3)、温度(50℃、1小时)处理后，接种12日龄鹅胚(0.2ml/胚)，另设生理盐水处理组作为对照。37℃培养7日。结果：分离毒经乙醚、氯仿和盐酸(pH3)处理的毒株，不影响病毒鹅胚中的增殖，鹅胚出现死亡，PCR检测结果阳性，表明病毒没有脂质囊膜，对乙醚和氯仿有抵抗力，耐酸。病毒对热处理稳定，能抵抗50℃、1小时。分离毒株的核酸类型为RNA。3.3PCR鉴定取分离株病毒200ul，利用RNA提取试剂盒提取病毒RNA，DNA提取试剂盒提取病毒DNA，RNA反转录后，PCR检测鹅副粘、H5、H7、H9亚型禽流感、呼肠孤病毒及星状病毒，DNAPCR检测圆环病毒、禽腺病毒、小鹅瘟、番鸭细小病毒。PCR结束后1％琼脂糖凝胶电泳观察结果。PCR反应体系：总体积25ul在0.5m1PCR管中依次加入10×ExTaqMix-----------------12.5u1上游引物(20pmol)---------------1u1下游引物(20pmol)---------------1u1DNA----------------------------2ul用灭菌去离子水8.5ul补足至总体积25u1，PCR反应在PTC-100基因扩增仪内进行。PCR反应参本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种卵黄抗体，其特征在于，所述的卵黄抗体是用保藏编号为CCTCC No：V201820的新型鹅星状病毒GD 0122株制备的灭活疫苗作为抗原制备的。

【技术特征摘要】
1.一种卵黄抗体，其特征在于，所述的卵黄抗体是用保藏编号为CCTCCNo：V201820的新型鹅星状病毒GD0122株制备的灭活疫苗作为抗原制备的。2.如权利要求1所述的卵黄抗体，其特征在于，所述的卵黄抗体的制备方法如下：1)对产蛋鸡进行免疫用GD0122株制备的灭活疫苗进行免疫；具体如下：基础免疫每只鸡胸部肌肉注射疫苗0.5ml；二次免疫在基础免疫后14日进行第2次接种，每只鸡胸部肌肉注射1.0ml；三次免疫在二次免疫后14日进行第3次接种，每只鸡胸部肌肉注射1.0ml；维持免疫：当卵黄中鹅星状病毒琼扩抗体效价1:96时，维持接种1次，每只鸡胸部肌肉注射疫苗1.0ml；收蛋：三次强化免疫后10日，抽样取蛋，分离卵黄，提取抗体，鹅星状病毒琼扩抗体效价≥1:64为合格，收集高免鸡蛋；2)抗体制造收集蛋黄将蛋黄液加入巴氏灭菌罐中，加入适量...

【专利技术属性】
技术研发人员：常娓娓，罗济冠，王学波，刘志亮，王丹娜，郭春丽，王相芹，康正武，李朝阳，
申请(专利权)人：山东信得科技股份有限公司，青岛信得药业有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37