一种基于原核表达诺如病毒抗原表位的亚单位疫苗及其制备方法技术

本发明专利技术涉及生物医药领域，尤其是基于原核表达诺如病毒抗原表位亚单位疫苗的制备方法。本发明专利技术提供了一种原核表达的亚单位疫苗，用于刺激机体产生对抗诺如病毒的特异性抗体，其特征在于诺如病毒重组抗原序列为SEQ ID  NO:1，来源：NCBI Reference Sequence:NC_029646.1，人诺如病毒GII型的中和表位：105bp，表达载体为：改造过的乙型肝炎核心抗原（HBcAg）基因克隆于pThioHisA表达载体。

【技术实现步骤摘要】
一种基于原核表达诺如病毒抗原表位的亚单位疫苗及其制备方法
本专利技术涉及生物医药领域，尤其是基于原核表达诺如病毒抗原表位亚单位疫苗的制备方法。
技术介绍
诺如病毒(Norovirus,NoV)是人类急性胃肠炎的主要病原,由于其所引起的胃肠炎具有明显的季节性,曾在1929年被称为“冬季呕吐病”。诺如病毒基因型别的复杂和诺如病毒型间的快速变异,使得诺如病毒疫苗的研制进程缓慢,迄今为止,尚无稳定有效的可供大规模接种的疫苗,亦无安全稳定的抗毒血清用以紧急防护高危暴露人群。诺如病毒属于杯状病毒科(Calicivirus)诺瓦克病毒属，病毒RNA包含3个可读框(openreadingframes,ORFs)。诺如病毒根据其RNA多聚酶和衣壳蛋白序列同源性差异可分为7个基因组:GroupI(GI)-GroupVII(GVII)。其中，GI,GII,GIV主要感染人和非人类灵长类动物,GIII主要感染牛和羊，GV感染鼠，GVI主要感染狗。根据诺如病毒ORF2全基因序列相似性，GⅠ可进一步分为14个基因型(genotypes)，GⅡ可分为27个基因型。对编码病毒衣壳蛋白的VP1序列的分析研究表明，不同基因组间的差别在50％以上，而同一基因组的不同基因型间差异高达40％。目前，对于诺如病毒的感染没有有效的抗病毒药物，预防诺如病毒感染最有效的措施还是研发针对性的疫苗。诺如病毒的体外培养一直是制约诺如病毒疫苗的一个重要因素，同时没有合适的动物模型也是制约传统疫苗研发较的关键，虽然最新研究表明，可以通过人的小肠干细胞来源的肠道样组织实现诺如病毒的体外培养，但是肠道样组织很难建立和维持，并不适合于传统大批量疫苗研发、生产所需，所以基因工程疫苗便成为了诺如病毒疫苗研发的最佳选择。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供了一种原核表达的亚单位疫苗，用于刺激机体产生对抗诺如病毒的特异性抗体。一种基于原核表达诺如病毒抗原表位的亚单位疫苗，其特征在于诺如病毒重组抗原序列为SEQIDNO:1，来源：NCBIReferenceSequence:NC_029646.1，人诺如病毒GII型的中和表位：105bp。表达载体为：改造过的乙型肝炎核心抗原(HBcAg)基因克隆于pThioHisA表达载体。基于原核表达诺如病毒抗原表位亚单位疫苗的制备方法，包括载体构建、诱导表达、诺如病毒重组抗原的纯化等过程，其特征在于诺如病毒重组抗原的纯化具体如下：步骤1、硫酸铵盐析法初步纯化重组蛋白将获得的超声上清液，按每1ml上清液加入0.243g硫酸铵进行40％硫酸铵沉淀，室温沉淀30min，期间上下颠倒混匀，8000rpm,4℃离心30min，弃掉上清，沉淀用PB重悬，获得的蛋白液体冻存至-80℃保存；所取的各个蛋白样品加入等体积的2×LoadingBuffer，金属浴100℃煮10min；将上述获得的表达产物样品经12％的SDS-PAGE进行分离鉴定；步骤2、离子交换层析纯化重组蛋白将Q-FF离子交换凝胶柱安装于蛋白质分离纯化系统中；用PB缓冲液(PH值为8)对Q-FF离子交换凝胶柱进行平衡，上样，分别用20％、40％、60％、80％、100％的NaCl溶液进行洗脱收取样品；所取的各个蛋白样品加入等体积的2×LoadingBuffer，金属浴100℃煮10min；将上述获得的表达产物样品经12％的SDS-PAGE进行分离鉴定。本专利技术的诺如病毒重组抗原序列针对于GII型诺如病毒特异性强、灵敏度高、可用于诺如病毒型别之间的鉴定。改造过的乙型肝炎核心抗原(HBcAg)基因克隆于pThioHisA表达载体，该载体允许插入外源蛋白具有很好的免疫原性优势。与现有的毕赤酵母菌系统表达诺如病毒相比，本专利技术应用原核系统表达诺如病毒蛋白，操作简单，在疫苗开发等领域有着明显的优势。附图说明图1鉴定重组质粒琼脂糖电泳分析结果图图2鉴定诱导蛋白的可溶性分析结果图图3鉴定重组蛋白纯化分析结果图图4纯化结果WB检测结果图图5ELISA效价检测图具体实施方式1材料1.1诺如病毒重组抗原序列设计来源：NCBIReferenceSequence:NC_029646.1人诺如病毒GII型的中和表位：105bp。具体序列如下：GGATCCAACCACGTGTGGAACATGCAGGTTGGTGGCGGTGGCAGCGCGAAGTTCACCCCGAAACTGGGTGCGATCCAAATTGGCACCTGGGAGGAAGACGAATTC下划线部分为链接肽1.2酶名称备注BamHⅠ购自NEB公司EcoRⅠ购自NEB公司T4链接酶购自NEB公司1.3载体1.4试剂与试剂盒1.5仪器名称备注摇床购自北京市六一仪器厂，型号为WD-9405B型电泳仪购自美国BIO-RAD公司，型号为200/2.0PowerSupply超声破碎仪购自宁波新芝有限公司，型号为JY92-IIN水浴锅购自一恒科学仪器有限公司，型号为DK-8D凝胶成像仪购自Bio-Rad公司，型号为UniversalHoodⅡ超净台购自安泰空气技术有限公司，型号为SW-CJ-2F金属浴购自上海蓝豹实验仪器有限公司，型号为TU-10Q-FF离子交换凝胶柱购自GEhealthcare公司离心机购自Hitachi公司，型号为CR21G2方法2.1载体构建2.1.1合成质粒用无菌水溶解后，将其转化进DH5a感受态细菌。2.1.2挑单克隆接种于约5ml具有氨苄青霉素抗性的LB培养基中，37℃，220rpm/min，振荡培养过夜，从获得的细菌中提取带有NOV片段的质粒。2.1.3将获得的质粒应用限制性内切酶BamHⅠ和EcoRⅠ对其分别进行双酶切获得目的片段和载体。2.1.437℃水浴2h，1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，在长波紫外灯下切下目的片段，用琼脂糖凝胶回收试剂盒纯化目的片段。获得的目的片段，可直接应用于后续的连接实验。2.1.5测定目的片段及NP载体片段的浓度，分别为：NOV:950ng/ul；NP：850ng/ul。NP载体片段与目的的片段以质量比1：4.5进行连接，连接反应体系如下：2.1.616℃反应12-16h，将连接产物转化进DH5a细菌后涂布到具有氨苄卡那霉素的LB平板上，倒置培养过夜。2.1.7挑单克隆接种于约5ml具有氨苄青霉素抗性的LB培养基中，37℃，220rpm/min，振荡培养过夜。之后从获得的细菌培养液中提取NP-NOV质粒。2.1.8获得质粒后，应用限制性内切酶BamHⅠ和EcoRⅠ对其分别进行双酶切鉴定，酶切反应体系如下：2.1.937℃水浴中反应2h后对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。2.2诱导表达2.2.1将带有鉴定正确质粒的细菌接种于5ml具有氨苄青霉素抗性的LB培养基中，37℃，220rpm/min，振荡培养过夜。2.2.2将菌液按5％转接至新的LB液体培养基内，培养至菌液OD600值为0.4-0.6时，加入浓度为1mM的IPTG诱导4h。取未加诱导剂的菌液1ml，之后加入浓度为1mM的IPTG进行诱导4h，之后取诱导4h后的菌液1ml，12，000rpm，4℃离心5min，倾倒上清液，获得的菌体沉淀用0.02M的PB重悬。2.2.3将重悬液进行超声破碎：30min，每次超声10s，间隔10s，功率为20％。超声破碎后的菌液本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于原核表达诺如病毒抗原表位的亚单位疫苗，其特征在于诺如病毒重组抗原序列为SEQ ID NO:1，来源 ：NCBI Reference Sequence: NC_029646.1，人诺如病毒GII型的中和表位：105bp。

【技术特征摘要】
1.一种基于原核表达诺如病毒抗原表位的亚单位疫苗，其特征在于诺如病毒重组抗原序列为SEQIDNO:1，来源：NCBIReferenceSequence:NC_029646.1，人诺如病毒GII型的中和表位：105bp。2.如权利要求1所述的基于原核表达诺如病毒抗原表位的亚单位疫苗，其特征在于表达载体为：改造过的乙型肝炎核心抗原（HBcAg）基因克隆于pThioHisA表达载体。3.一种基于原核表达诺如病毒抗原表位亚单位疫苗的制备方法，包括载体构建、诱导表达、诺如病毒重组抗原的纯化等过程，其特征在于诺如病毒重组抗原的纯化具体如下：步骤1、硫酸铵盐析法初步纯化重组蛋白将获得的超声上清液，按每1ml上清液加入0.243g硫酸铵进行40%硫酸铵沉淀，室温沉淀3...

【专利技术属性】
技术研发人员：李鸿钧，刘洋，林晓晨，周艳，吴晋元，解裕萍，
申请(专利权)人：中国医学科学院医学生物学研究所，
类型：发明
国别省市：云南,53