一种视网膜干细胞定向分化为视网膜细胞的诱导方法技术

本发明专利技术提供一种视网膜干细胞定向分化为视网膜细胞的诱导方法，包括：对视网膜干细胞进行分离、培养及鉴定；通过胎牛血清和TGF‑β2对选取的传代培养的第六代视网膜干细胞进行诱导分化，对比观察血清组与TGF‑β2组分化细胞的程度及数量的不同。利用本发明专利技术，能够解决现有的干细胞不适于临床应用中的直接移植的问题。

【技术实现步骤摘要】
一种视网膜干细胞定向分化为视网膜细胞的诱导方法
本专利技术涉及干细胞培养及分化
，更为具体地，涉及一种视网膜干细胞定向分化为视网膜细胞的诱导方法。
技术介绍
干细胞(embryonicstemcells，ES细胞)的研究是最近几十年生命科学研究领域发展最快和最受重视的前沿生物技术之一。干细胞研究的科学价值在于其诱人的应用前景。任何涉及丧失正常细胞的疾病，都可以移植由干细胞分化而来的特异组织细胞来治疗。通过移植视网膜干细胞(RetinaStemCell，RSC)使其整合入视网膜各层并诱导其增殖分化为目标细胞，补充缺失的视网膜神经元，重建视网膜功能，将给不可逆性致盲眼病患者带来希望。目前，哺乳动物视网膜干细胞的研究主要集中在干细胞的分离及定向分化方面，其中分化的研究工作未有明显进展，使用的方法及其效果存在较大差异，远没有形成一些公认的较成熟的方法。视网膜干细胞体外增殖的研究已经取得了一定进展，一些干细胞系已经建立，但视网膜干细胞移植的目的是要其在移植部位分化为成熟的视网膜细胞，替代已经损伤的视网膜细胞。因此，对视网膜干细胞分化的研究是极其重要的。目前，关于视网膜干细胞诱导分化的文献本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种视网膜干细胞定向分化为视网膜细胞的诱导方法，包括：对视网膜于细胞分离、传代培养及鉴定；分别通过TGF‑β2和胎牛血清对视网膜干细胞诱导分化，并对诱导分化结果进行鉴定；对比观察TGF‑β2与胎牛血清分化细胞的程度及数量的不同。

【技术特征摘要】
1.一种视网膜干细胞定向分化为视网膜细胞的诱导方法，包括：对视网膜于细胞分离、传代培养及鉴定；分别通过TGF-β2和胎牛血清对视网膜干细胞诱导分化，并对诱导分化结果进行鉴定；对比观察TGF-β2与胎牛血清分化细胞的程度及数量的不同。2.如权利要求1所述的视网膜干细胞定向分化为视网膜细胞的诱导方法，其特征在于，对视网膜干细胞分离、传代培养及鉴定包括：对视网膜干细胞进行分离，获取到所述视网膜干细胞的原代细胞；对所述视网膜干细胞的原代细胞进行传代培养；对培养的视网膜干细胞进行鉴定。3.如权利要求2所述的视网膜干细胞定向分化为视网膜细胞的诱导方法，其特征在于，在分别通过TGF-β2和胎牛血清对视网膜干细胞诱导分化，并对诱导分化结果进行鉴定过程中，通过所述TGF-β2对选取的传代培养的第六代视网膜干细胞进行诱导分化，并对诱导分化结果进行鉴定；通过所述胎牛血清对选取的传代培养的第六代视网膜干细胞进行诱导分化，并对诱导分化结果进行鉴定。4.如权利要求1所述的视网膜干细胞定向分化为视网膜细胞的诱导方法，其特征在于，在对视网膜干细胞进行分离之前，先进行视网膜取材，其中，2.5％戊巴比妥纳2ml注射孕昆明小鼠的腹腔，并脱颈处死；然后浸入75％酒精中浸泡，15分钟后取出动物移至无菌手术台；打开腹腔取出双角子宫，浸入4℃无菌生理盐水，取出胚胎，剖出胎鼠眼球；将胎鼠眼球置于少量生理盐水的培养皿内，并去除眼球外组织和视神经，沿角巩膜缘剪开眼球，去除晶状体和玻璃体；翻转眼杯，取睫状体部组织及视网膜色素层，移入装有培养液的离心管中。5.如权利要求2所述的视网膜干细胞定向分化为视网膜细胞的诱导方法，其特征在于，在对视网膜干细胞进行分离的过程中，打开放置视网膜的离心管，加入胶原酶消化1h后用吸管轻轻吹打，将组织打碎后，1000r/min离心3分钟；弃上清，加入0.25％胰蛋白酶的混合消化液5ml，37℃条件下震荡消化5分钟；如有单细胞释出，加入培养液5ml稀释，再加以吹打5min后1000r/min离心5分钟，弃上清；加入视网膜干细胞培养液5ml中止消化，继续用吸管轻轻吹打5min；采用80目及200目不锈钢滤网先后过滤，制成单细胞悬液。6.如权利要求5所述的视网膜干细胞定向分化为视网膜细胞的诱导方法，其特征在于，取所述单细胞悬液0.5ml加入试管中，加入等体积0.4％台盼兰染液，染色2-3分钟；吸取混合后的悬液涂于加有盖玻片的血球计数板上，1分钟后计数100个细胞，未着色的为活细胞，死细胞染成蓝色；其中，细胞活力＝活细胞/细胞总数×100％。7.如权利要求5所述的视网膜干细胞定向分化为视网膜细胞的诱导方法，其特征在于，通过细胞计数确定细胞接种密度，具体步骤如下：将血球计数板及盖片擦拭干净，并将所述盖片盖在所述血球计数板上；将所述单细胞悬液吸出少许，滴加在所述盖片边缘，使所述单细胞悬液充满所述盖片和所述血球计数板之间；静置3分钟，显微镜下观察，并计算所述血球计数板上的四大格细胞总数，其中，按下式计算：细胞数/ml＝4大格细胞总数/4×10000；将细胞悬液稀释到密度为5×104/ml，然后接种于25ml培养瓶；所述培养瓶中为完全培养基：DMEM/F12，1％B27，bFGF，将所述单细胞悬液放在37℃，、5％CO2培养箱中培养。8.如权利要求1所述的视网膜干细胞定向分化为视网膜细胞的诱导方法，其特征在于，在对所述视网膜干细胞的原代细胞进行传代培养过程中，原代细胞培养3天以后，出现较小的细胞球，呈悬浮生长于培养液中，培养瓶静置30min后，吸除一半培养液，加入同量的新鲜培养液即可；显微镜下观察细胞，细胞团大量出现，并且出现细胞球融合或者相连贴壁于瓶底时，先静置培养瓶30min，...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯霞，张丽娟，
申请(专利权)人：冯霞，
类型：发明
国别省市：山东,37