角膜缘干细胞原代培养方法技术

本发明专利技术涉及一种角膜缘干细胞原代培养方法。其特征在于经庆大霉素溶液处理后的角膜缘组织剪碎后置于组织消化液中消化、过滤，并将滤液离心后获得的角膜缘组织细胞沉淀进行短暂冻存，再将过滤剩余的组织块（即滤渣）用角膜缘干细胞滋养层培养液重悬，接种于用包被液预处理的细胞培养板进行培养，获得角膜缘成纤维细胞，然后用丝裂霉素C溶液处理生长至对数期的角膜缘成纤维细胞，制成角膜缘干细胞滋养层，最后复苏短暂冻存的组织细胞，用角膜缘干细胞原代培养液重悬后，接种在铺有角膜缘干细胞滋养层的细胞培养板中进行原代培养即得。该角膜缘干细胞安全性高、稳定性好，完好地满足了临床治疗的高要求。

Primary culture of limbal stem cells

The invention relates to a primary culture method of corneal limbal stem cells. The corneal limbal tissue treated with gentamicin solution is cut up and digested and filtered in tissue digestion solution. The corneal limbal tissue cells obtained by centrifugation of the filtrate are frozen for a short time. The remaining filtered tissue blocks (i.e. filtered residue) are suspended in the trophoblast medium of limbal stem cells and inoculated in the cell culture plate pretreated with the coating solution for culture. Corneal limbal fibroblasts were obtained, and then treated with mitomycin C solution to grow to logarithmic phase to form limbal stem cell trophoblast. Finally, the frozen tissue cells were resuscitated. After resuspension with the primary culture medium of limbal stem cells, they were inoculated into the cell culture plate with limbal stem cell trophoblast layer for primary culture. The corneal limbal stem cells have high safety and stability, and can well meet the high requirements of clinical treatment.

【技术实现步骤摘要】
角膜缘干细胞原代培养方法
本专利技术属于干细胞培养
，具体涉及一种角膜缘干细胞原代培养方法。
技术介绍
研究发现，角膜缘干细胞位于角膜缘基底层独特的波浪形结构“Vogt栅栏”中，是角膜上皮细胞更新的来源。角膜缘干细胞不断的更新能够保持角膜缘上皮细胞连续性的水平向心及垂直向上运动，从而保证角膜上皮层结构的完整和功能的正常。而且角膜缘干细胞的增殖压力能够抑制结膜上皮细胞的长入，并防止角膜缘部的结膜血管入侵。当各种损伤因素，如化学烧伤、机械损伤、病原微生物感染等，会导致角膜缘干细胞的缺失或影响其生存微环境而使其生理功能严重受损时，将引起角膜上皮结构不能重建，结膜上皮及血管翳移行修复角膜表面，导致角膜混浊、视功能下降。因此，必须通过原代培养在体外获得能够快速增殖且保持干细胞属性的角膜缘干细胞，以用于角膜缘缺损/病变的治疗，这也是现今临床移植治疗该类疾病的关键环节。目前，角膜缘干细胞的原代培养方法较多：角膜缘干细胞的体外分离一般采用组织块迁出法和酶消化法（酶消化法包括IV型胶原酶联合胰蛋白酶、中性蛋白酶联合胰蛋白酶等）；培养采用的滋养层主要包括小鼠NIH3T3细胞滋养层、小鼠胚胎成纤维细胞滋养层等；培养液成分一般包括血清、生长因子、霍乱毒素、胰岛素、3-碘甲状腺原氨酸、氢化可的松等。现有的上述角膜缘干细胞的培养方法虽能获得上皮细胞，但都存在一定的局限：在原代培养涉及的体外分离环节中，采用组织块迁出法得到的细胞很容易混有其它种类的细胞，如成纤维细胞，且该成纤维细胞生长速度极快而造成细胞种类混杂；上述的胰蛋白酶为肽链内切酶，对精氨酸和赖氨酸肽链具有选择性水解作用。由于血清中含有非特异性抑肽酶，故胰蛋白酶在有血清存在的情况下无法消化正常组织，但若将组织长时间置于无血清的消化液中进行消化，势必会造成细胞活力的下降；在滋养层的选择方面，NIH3T3细胞和胚胎成纤维细胞为外生非人源细胞，容易引起免疫反应及鼠源衍生病原体的传播，存在致病风险；在培养液成分的选择上，其中霍乱毒素是霍乱弧菌产生的毒力因子，会引起严重腹泻以及人体脱水，而3-碘甲状腺原氨酸是甲状腺激素的主要活性物质，但高浓度的甲状腺激素能够促进蛋白质分解，引起负氮平衡。上述因素均能影响体外原代培养的角膜缘干细胞的活性和生物安全性。此外，现有方法获得的角膜缘干细胞容易发生分化，从相当程度上丢失了角膜缘干细胞的属性而导致患者移植后存在角膜缘功能不全的风险。因此，急需建立一种理想的角膜缘干细胞原代培养方法，在保证角膜缘干细胞的生物安全性的基础上，能够很好地维持其干细胞属性而不发生分化，以期用于临床治疗。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种角膜缘干细胞原代培养方法，以克服现有技术的不足，实现临床治疗的需求。本专利技术的方法：首先用无菌0.9%（w/v）生理盐水清洗角膜缘组织（角膜与巩膜之间宽约2mm的区域，来源于捐献角膜移植后剩余的边角料），再将清洗后的角膜缘组织浸没在庆大霉素溶液中，于37℃处理10min，而后用无菌PBS平衡盐溶液冲洗3遍，DMEM/F12（1:1）培养基漂洗3遍；再将上述的角膜缘组织置于500μl组织消化液中，用眼科剪将组织剪切成大小约0.5~1mm3的小块；然后补加4.5ml组织消化液，置于37℃恒温摇床中，60rpm消化2~4h；之后，将消化后的角膜缘组织悬液用200目的细胞筛网进行过滤，并分别收集滤液和剩余的组织块（即滤渣）；然后将上述滤液于500rpm离心10min，去上清后的组织细胞沉淀进行常规的短暂冻存；之后将上述滤渣用角膜缘干细胞滋养层培养液重悬，并均匀地铺在用包被液预处理的细胞培养板中，待细胞迁出并长满单层后，进行常规的细胞传代，获得角膜缘成纤维细胞并接种于包被液预处理的细胞培养板中，待细胞长至对数生长期，吸出培养液，加入丝裂霉素C溶液，37℃避光孵育2h后，弃掉其中的丝裂霉素C溶液，再用无菌PBS平衡盐溶液漂洗后作为角膜缘干细胞滋养层；然后将上述短暂冻存的组织细胞进行常规复苏，于500rpm离心10min，去上清后，用角膜缘干细胞原代培养液重悬组织细胞沉淀，接种于铺有上述角膜缘干细胞滋养层的细胞培养板中，置于37℃、5%CO2培养箱中进行体外培养，每1~2天使用角膜缘干细胞原代培养液进行换液处理，即可获得原代培养的角膜缘干细胞。本专利技术上述的庆大霉素溶液的配方：含有100U/ml庆大霉素的DMEM/F12（1:1）培养基。上述组织消化液的配方：2.4~4.8U/ml的DispaseII酶溶解于含有5%胎牛血清的DMEM/F12（1:1）培养基。上述角膜缘干细胞滋养层培养液的配方：含有10%胎牛血清和10~20ng/ml碱性成纤维细胞生长因子的DMEM/F12（1:1）培养基。上述包被液的配方：含有10~30μg/ml纤连蛋白、5~20μg/ml层粘连蛋白5和1~2mg/ml明胶的DMEM/F12（1:1）培养基。上述丝裂霉素C溶液的配方：含有10μg/ml丝裂霉素C的DMEM/F12（1:1）培养基。上述角膜缘干细胞原代培养液的配方：含有5~10%胎牛血清、10~40ng/ml表皮生长因子、10~20ng/ml碱性成纤维细胞生长因子、1~10μg/ml胰岛素、1~10μg/ml转铁蛋白、1~5ng/ml亚硒酸钠、0.2~1μg/ml氢化可的松、5~20ng/ml白血病抑制因子、5~10ng/ml白介素-6、5~20μg/ml纤连蛋白、5~10μg/ml层粘连蛋白5和5~10%角膜缘成纤维细胞（对数期）培养上清液的DMEM/F12（1:1）培养基。上述包被液预处理细胞培养板的制备方法：吸取包被液加至所述细胞培养板底，待该板底完全润湿后，将多余的包被液吸出，再将细胞培养板放置在超净工作台风干1h。由于本专利技术未使用鼠源细胞作为滋养层，而是巧妙地利用了增殖能力很强的角膜缘成纤维细胞并通过丝裂霉素C处理后作为角膜缘干细胞的滋养层，这样一方面排除了异源衍生病原体传播的可能，另一方面角膜缘成纤维细胞本身就是角膜缘微环境的组分，达到更好地模拟体内环境，使角膜缘干细胞保持天然属性。此外，本专利技术的角膜缘干细胞原代培养液中也未添加霍乱毒素，因此，培养获得的角膜缘干细胞不存在致病风险、安全性更高，且其中涉及的角膜缘干细胞原代培养液中添加的因子以及包被液中的成分，能够很好的保证角膜缘干细胞属性的稳定性，而不发生分化。具体实施方式本专利技术涉及的各种溶液的配制方法如下：1、上述庆大霉素溶液的配制方法：取10mlDMEM/F12（1:1）培养基，加入10mg庆大霉素（效价1000U/mg），完全溶解后用0.22μm的针头滤器过滤除菌，然后用DMEM/F12（1:1）培养基定容至100ml。2、上述组织消化液的配制方法：取10mlDMEM/F12（1:1）培养基，加入24~48mgDispaseII酶（酶活10U/mg），完全溶解后用0.22μm的针头滤器过滤除菌，然后再加入5ml胎牛血清，最后用DMEM/F12（1:1）培养基定容至100ml。3、上述角膜缘干细胞滋养层培养液的配制方法：取10mlDMEM/F12（1:1）培养基，加入1~2μg碱性成纤维细胞生长因子，完全溶解后用0.22μm的针头滤器过滤除菌，然后再加入10ml胎牛血清，最后用DMEM/F12本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种角膜缘干细胞原代培养方法，其特征在于首先将清洗干净的角膜缘组织浸没在庆大霉素溶液中进行消毒和漂洗，然后将角膜缘组织置于组织消化液中，剪切成小块后补加组织消化液进行消化，而后过滤，将滤液离心后获得的角膜缘组织细胞沉淀进行短暂冻存，再将过滤剩余的组织块用角膜缘干细胞滋养层培养液重悬，接种于用包被液预处理的细胞培养板进行培养，获得角膜缘成纤维细胞，然后用丝裂霉素C溶液处理制备角膜缘干细胞滋养层，再复苏短暂冻存的组织细胞，用角膜缘干细胞原代培养液重悬后，接种在铺有角膜缘干细胞滋养层的细胞培养板中进行原代培养，即可获得角膜缘干细胞；上述庆大霉素溶液是含有100 U/ml庆大霉素的DMEM/F12培养基；上述组织消化液是2.4~4.8 U/ml的Dispase II酶溶解于含有5%胎牛血清的DMEM/F12培养基；上述角膜缘干细胞滋养层培养液是含有10%胎牛血清和10~20 ng/ml碱性成纤维细胞生长因子的DMEM/F12培养基；上述包被液的配方是含有10~30 μg/ml纤连蛋白、5~20 μg/ml层粘连蛋白5和1~2 mg/ml明胶的DMEM/F12培养基；上述丝裂霉素C溶液是含有10 μg/ml丝裂霉素C的DMEM/F12培养基；上述角膜缘干细胞原代培养液的配方是含有5~10%胎牛血清、10~40 ng/ml表皮生长因子、10~20 ng/ml碱性成纤维细胞生长因子、1~10 μg/ml胰岛素、1~10 μg/ml转铁蛋白、1~5 ng/ml亚硒酸钠、0.2~1 μg/ml氢化可的松、5~20 ng/ml白血病抑制因子、5~10 ng/ml白介素‑6、5~20 μg/ml纤连蛋白、5~10 μg/ml层粘连蛋白5和5~10%处于生长对数期的角膜缘干细胞滋养层培养上清液的DMEM/F12培养基。...

【技术特征摘要】
1.一种角膜缘干细胞原代培养方法，其特征在于首先将清洗干净的角膜缘组织浸没在庆大霉素溶液中进行消毒和漂洗，然后将角膜缘组织置于组织消化液中，剪切成小块后补加组织消化液进行消化，而后过滤，将滤液离心后获得的角膜缘组织细胞沉淀进行短暂冻存，再将过滤剩余的组织块用角膜缘干细胞滋养层培养液重悬，接种于用包被液预处理的细胞培养板进行培养，获得角膜缘成纤维细胞，然后用丝裂霉素C溶液处理制备角膜缘干细胞滋养层，再复苏短暂冻存的组织细胞，用角膜缘干细胞原代培养液重悬后，接种在铺有角膜缘干细胞滋养层的细胞培养板中进行原代培养，即可获得角膜缘干细胞；上述庆大霉素溶液是含有100U/ml庆大霉素的DMEM/F12培养基；上述组织消化液是2.4~4.8U/ml的DispaseII酶溶解于含有5%胎牛血清的DMEM/F12培养基；上述角膜缘干细胞滋养层培养液是含有10%胎牛血清和10~20ng/ml碱性成纤维细胞生长因子的DMEM/F12培养基；上述包被液的配方是含有10~30μg/ml纤连蛋白、5~20μg/ml层粘连蛋白5和1~2mg/ml明胶的DMEM/F12培养基；上述丝裂霉素C溶液是含有10μg/ml丝裂霉素C的DMEM/F12培养基；上述角膜缘干细胞原代培养液的配方是含有5~10%胎牛血清、10~40ng/ml表皮生长因子、10~20ng/ml碱性成纤维细胞生长因子、1~10μg/ml胰岛素、1~10μg/ml转铁蛋白、1~5ng/ml亚硒酸钠、0.2~1μg/ml氢化可的松、5~20ng/ml白血病抑制因子、5~10ng/ml白介素-6、5~20μg/ml纤连蛋白、5~10μg/ml层粘连蛋白5和5~10%处于生长对数期的角膜缘干细胞滋养层培养上清液的DMEM/F12培养基。2.如权利要求1所述的角膜缘干细胞原代培养方法，其特征是上述的细胞培养板预处理的方法：吸取包被液加至细胞培养板底，待板底...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐彬，樊廷俊，田成磊，郑明月，
申请(专利权)人：中国海洋大学，
类型：发明
国别省市：山东,37