基于磁流变液技术的恒温扩增型太赫兹多通道微流控芯片及其用于病原菌检测的方法技术

本发明专利技术公开了基于磁流变液技术的恒温扩增型太赫兹多通道微流控芯片及其用于病原菌检测的方法，包括滚环扩增(Rolling circle amplification,RCA)反应模块、磁流变液交换模块、超材料纳米颗粒信号放大模块和微流体芯片结构。微流体芯片结构为设置有多条检测通道的“罗盘型”结构，中心设置有总入口，每条检测通道由内至外依次连接有RCA反应模块、磁流变液交换模块和超材料纳米颗粒信号放大模块。检测方法利用RCA、磁流变液和超材料纳米颗粒信号放大模块解决水敏感性、灵敏度低的问题。作为一种快速、准确检测病原菌的新方法，对感染性疾病的诊断和治疗具有重要的意义。

【技术实现步骤摘要】
基于磁流变液技术的恒温扩增型太赫兹多通道微流控芯片及其用于病原菌检测的方法
本专利技术涉及病原菌检测领域，具体涉及基于磁流变液技术的恒温扩增型太赫兹多通道微流控芯片，还涉及利用微流控芯片检测病原菌的方法。
技术介绍
快速准确检测病原菌的种属，对于感染性疾病的诊断和后续治疗至关重要。传统的病原菌检测方法所需时间较长，从收集标本到准确获取病原菌的类型通常需要几天到一周左右。此外，细菌培养操作繁琐，且不同细菌需要不同的酶学和生化反应鉴定而消耗大量的试剂。为了快速鉴定病原菌的种属，一系列包括飞行质谱技术、荧光定量PCR、核酸测序在内的分子生物学方法被提出，但由于各自弊端这些方法均未能替代传统的细菌培养与鉴定方法。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)可通过细菌特异性的电荷区分不同类型的病原菌，但其检测灵敏度仅为105-106CFU4。此外，质谱技术只能检测培养后的单一样本，无法检测混合样本，并在区分大肠杆菌和志贺氏菌等方面仍存在一定的缺陷。荧光定量PCR方法可以通过不同荧光标记同时检测多种病原菌，但是受限于仪器昂贵、操作繁琐，无法在实际临床工作中常规展开。因此，建立一种快速、准确检测病原菌的新方法对于感染性疾病的诊断和治疗具有重要的意义。太赫兹(Terahertz,THz)波是指频率为0.1-10THz，波长为3mm到30μm，介于毫米波与红外光之间频谱范围的电磁波。近几年来，THz波在生物医学应用领域掀起了研究热潮，已经成为当前物理学与生物医学交叉领域收到极大重视的研究热点。在病原菌检测方面，组成病原菌的核酸、蛋白、糖类和脂类等生物大分子之间/内的弱相互作用力(氢键、范德华力等)、骨架震动和转动的能级等正好处于THz波的频率范围内，使得THz波对病原菌内部的含水量和胞内结构等代谢变化具有较好的敏感性。因此，可以通过病原菌内部含水量和胞内结构的差异实现不同种属病原菌的区分。但是利用现有THz波检测技术检测病原菌仍然存在特异性、灵敏度和水敏感性问题。(1)特异性问题：THz波对病原菌菌体进行直接检测是利用不同种属病原菌胞内含水量和胞内结构不同的原理，这种方法虽然可以区分纯化培养后的病原菌，但是本质上并不具备较高的检测特异性。考虑到临床样本存在结果类似的病原菌或多种病原菌混杂的情况，直接检测的方式无法在临床样本中特异地区分病原菌的种属。(2)灵敏度问题：前期研究结果表明，在不借助任何信号放大技术的前提下，THz光谱只能检测到108CFU以上的病原菌。(3)水敏感问题：室温时1THz频率下水对THz波的吸收系数高达250cm-1左右，液相环境中病原菌的THz吸收信号往往被湮没。因此，由于特异性、敏感性和水敏感性问题的限制，现有的THz波检测技术尚无法满足临床病原菌的实际检测需求。磁流变液是一种在外加磁场作用下材料特性发生急剧变化的新型智能材料。磁流变液由微米量级的可磁化的固体颗粒(分散质)分散于母液如硅油中形成的悬浮体，在外加磁场下流变性质会发生急剧变化，其粘度成数量级增加且表现出较强的抗剪切力，使材料整体呈类固体状，在此状态下材料的介电常数等物理特性也会发生进一步变化。由于磁流变液效应具有可逆性、响应迅速的特点，已经广泛应用于自动控制、医疗、汽车工业、飞机制造等诸多领域。但是目前为止，未见磁流变液技术用于太赫兹波检测领域的报道。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的之一在于提供一种基于磁流变液技术的恒温扩增型太赫兹多通道微流控芯片；本专利技术的目的之二在于提供利用所述的微流控芯片检测病原菌的方法，(1)通过设计特异性锁式探针对病原菌靶核酸片段进行杂交反应，形成的环状DNA分子模板被包被的捕获探针捕获，并在Phi29DNA聚合酶作用下进行等温扩增反应，提高检测特异性；(2)同时将RCA产物与纳米颗粒结合，形成“RCA产物-纳米颗粒”聚合物，利用超材料纳米颗粒可提高灵敏度；(3)进一步再利用磁流变液技术解决水敏感性，通过磁流变液中的硅油和RCA反应体系中的水分子不互溶的特性，将RCA反应体系中的水分离，仅有磁流变液中的硅油作为溶剂进入超材料纳米颗粒信号放大模块，成功解决了水敏感性问题。同时在磁场作用下，样本整体会由液体状态变为类固体状，在此状态下进一步增大样本整体的介电常数，从而提高在超材料上的信号响应，实现太赫兹波检测灵敏度的二次提高。通过以上三种技术的联合，达到高特异性和高灵敏度检测病原菌的目的。为达到上述目的，本专利技术提供如下技术方案：1、基于磁流变液技术的恒温扩增型太赫兹多通道微流控芯片，包括RCA反应模块、磁流变液交换模块、超材料纳米颗粒信号放大模块和微流体芯片结构，所述微流体芯片结构为设置有多条检测通道的“罗盘型”结构，中心设置有总入口，每条检测通道由内至外依次连接有RCA反应模块、磁流变液交换模块和超材料纳米颗粒信号放大模块。优选的，所述RCA反应模块由两端设置有入口和出口的圆形腔室构成，RCA反应模块的圆形腔室两侧的微流体管道上各设置有一个控制阀门。优选的，所述磁流变液交换模块位于RCA反应模块和超材料纳米颗粒信号放大模块之间的微流体管道上，包含至少一个磁流变液管道。优选的，所述磁流变液管道的内径为12～15μm，所述微流体管道的内径为15～20μm；所述磁流变液的由直径为8～10μm的可磁化固体和硅油组成，所述可磁化固体的质量分数为20～40％，介电常数为40～70pf/mm；直径8～10μm的可磁化固体适合于结合“RCA产物-纳米颗粒”聚合物。优选的，所述超材料纳米颗粒信号放大模块含有超材料，所述超材料由硅基底上周期性排列的金属开口谐振环组成。优选的，所述超材料纳米颗粒信号放大模块的硅片为450～500μm厚，硅片上的金膜为150～250μm厚，每个周期由1～5个金属开口谐振环所组成，中间的缺口大小为3.5～5μm，在限定的缺口大小下“RCA产物-纳米颗粒”聚合物能够覆盖于超材料缺口内，有效介电常数改变导致电容的改变，最终导致了共振频率的位移。2、利用所述的微流控芯片检测病原菌的方法，包括如下步骤：(1)探针设计：根据不同病原菌的16SrDNA序列设计与不同病原菌靶序列相匹配的锁式探针和捕获探针，所述锁式探针与病原菌靶序列连接形成滚环扩增的环形模板，所述捕获探针特异性识别和捕获病原菌靶序列RCA产物；(2)样本准备：将不同的病原菌培养后，提取不同病原菌的基因组DNA，形成含有不同病原菌靶序列的混合样本溶液；(3)锁式探针与病原菌靶序列连接：在微流体芯片不同通道的RCA反应模块底部固定针对某一特定病原菌的捕获探针，然后分别加入含有针对某一特定病原菌的锁式探针的溶液，然后通过芯片中央的总入口向各个腔室内注入等量的含有不同病原菌靶序列的混合样本溶液，在腔室内特定的锁式探针可与特定病原菌靶序列连接形成滚环扩增的环形模板；(4)RCA反应：分别通过RCA反应模块腔室的入口注入RCA反应所需试剂：Phi29DNA聚合酶、dNTPs混合液、BSA和反应buffer进行RCA反应，反应后与模块底部包被的捕获探针结合固定，形成RCA产物复合物，从RCA反应模块腔室的入口注入纯水冲洗去除盐离子成分，从而对RCA产物进行纯化，然后将纯化的RCA产物复合物与纳米颗粒结合，形成“RCA产物-纳米颗粒”本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.基于磁流变液技术的恒温扩增型太赫兹多通道微流控芯片，其特征在于：包括RCA反应模块、磁流变液交换模块、超材料纳米颗粒信号放大模块和微流体芯片结构，所述微流体芯片结构为设置有多条检测通道的“罗盘型”结构，中心设置有总入口，每条检测通道由内至外依次连接有RCA反应模块、磁流变液交换模块和超材料纳米颗粒信号放大模块。

【技术特征摘要】
1.基于磁流变液技术的恒温扩增型太赫兹多通道微流控芯片，其特征在于：包括RCA反应模块、磁流变液交换模块、超材料纳米颗粒信号放大模块和微流体芯片结构，所述微流体芯片结构为设置有多条检测通道的“罗盘型”结构，中心设置有总入口，每条检测通道由内至外依次连接有RCA反应模块、磁流变液交换模块和超材料纳米颗粒信号放大模块。2.根据权利要求1所述基于磁流变液技术的恒温扩增型太赫兹多通道微流控芯片，其特征在于：所述RCA反应模块由两端设置有入口和出口的圆形腔室构成，RCA反应模块的圆形腔室两侧的微流体管道上各设置有一个控制阀门。3.根据权利要求1所述基于磁流变液技术的恒温扩增型太赫兹多通道微流控芯片，其特征在于：所述磁流变液交换模块位于RCA反应模块和超材料纳米颗粒信号放大模块之间的微流体管道上，包含至少一个磁流变液管道。4.根据权利要求3所述基于磁流变液技术的恒温扩增型太赫兹多通道微流控芯片，其特征在于：所述磁流变液管道的内径为12～15μm，所述微流体管道的内径为15～20μm；所述磁流变液材料由直径为8～10μm的可磁化固体和硅油组成，所述可磁化固体的质量分数为20～40％，介电常数为40～70pf/mm。5.根据权利要求1所述基于磁流变液技术的恒温扩增型太赫兹多通道微流控芯片，其特征在于：所述超材料纳米颗粒信号放大模块含有超材料，所述超材料由硅基底上周期性排列的金属开口谐振环组成。6.根据权利要求5所述基于磁流变液技术的恒温扩增型太赫兹多通道微流控芯片，其特征在于：所述超材料纳米颗粒信号放大模块的硅片为450～500μm厚，硅片上的金膜为150～250μm厚，每个周期由1～5个金属开口谐振环所组成，中间的缺口大小为3.5～5μm。7.利用权利要求1～6任一项所述的微流控芯片检测病原菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)探针设计：根据不同病原菌的16SrDNA序列设计与不同病原菌靶序列相匹配的锁式探针和捕获探针，所述锁式探针与病原菌靶序列连接形成滚环扩增的环形模板，所述捕获探针特异性识别并捕获病原菌靶序列RCA产物；(2)样本准备：将不同的病原菌培养后，提取不同病原菌的基因组DNA，形成含有不同病原菌靶序列的混合样本溶液；(3)锁式探针与病原菌靶序列连接：在微流体芯片不同通道的RCA反应模块底部固定针对某一特定病原菌的捕获探针，然后分别加入含有针对某一特定病原菌的锁式探针的溶液，然后通过芯片中央的总入口向各个腔室内注入等量的含有不同病原菌靶序列的混...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨柯，府伟灵，杨翔，
申请(专利权)人：中国人民解放军陆军军医大学第一附属医院，
类型：发明
国别省市：重庆,50