【技术实现步骤摘要】
一种定量测定ALS/AHAS酶催化反应过程中底物的转化及产物的生成及分布的方法
本专利技术属于酶学研究领域，具体涉及一种定量分析乙酰乳酸合酶(Acetolactatesynthase,ALS)及乙酰羟酸合酶(Acetohydroxylicacidsynthase,AHAS)催化反应过程中底物的转化及产物的生成及分布的方法。
技术介绍
乙酰乳酸合酶(Acetolactatesynthase,ALS)/乙酰羟酸合酶(Acetohydroxylicacidsynthase,AHAS)是催化生物体内异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸这三种必需支链氨基酸生物合成的第一步反应的限速酶。由于支链氨基酸只能在细菌、真菌、藻类及高等植物体内合成，而动物及人自身无法完成这些化合物的合成，必须从食物中获取，所以常常以支链氨基酸生物合成途径中的关键酶AHAS/ALS为靶标筛选抗菌药物和除草剂。事实上目前广泛使用的除草剂磺酰脲类(Sulfonylureas)化合物及咪唑啉酮类(Imidazolinones)化合物的作用靶点就是植物中的AHAS。目前，对于AHAS/ALS的催化机理研究已经越来越受到关...
【技术保护点】
1.1,2‑二氨基苯及其类似物和2,4‑二硝基苯肼(DNPH)及其类似物的组合，作为衍生化试剂以柱前衍生‑HPLC法定量检测乙酰乳酸合酶(ALS)/乙酰羟酸合酶(AHAS)催化反应底物的转化和产物的生成及分布特征的用途。
【技术特征摘要】
1.1,2-二氨基苯及其类似物和2,4-二硝基苯肼(DNPH)及其类似物的组合，作为衍生化试剂以柱前衍生-HPLC法定量检测乙酰乳酸合酶(ALS)/乙酰羟酸合酶(AHAS)催化反应底物的转化和产物的生成及分布特征的用途。2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：1,2-二氨基苯及其类似物包括1,2-二氨基苯(OPDA)，1,2-二氨基-4,5-亚甲二氧基苯(DMB)，1,2-二氨基-4,5-乙二氧基苯(DEB)，4-氯-1,2-二氨基苯(CPDA)，4-硝基-1,2-二氨基苯(NPDA)，4-甲氧基-1,2-二氨基苯(MPDA)，4,5-二氯-1,2-二氨基苯(DCPDA)，4,5-二甲氧基-1,2-二氨基苯(DMPDA)，它们的结构如下：3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：2,4-二硝基苯肼及其类似物包括2,4-二硝基苯肼(DNPH)，N-正丙胺-4-肼基萘二甲酰亚胺(NPHNA)，它们的结构如下：4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述1,2-二氨基苯及其类似物以1.0-3.0M盐酸配制为5.0-10.0mM储备液；2,4-二硝基苯肼及其类似物以甲醇配制为5.0-10.0mM储备液。5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：乙酰乳酸合酶(ALS)、乙酰羟酸合酶(AHAS)均从微生物获得；这两种酶催化反应类似，均包括两种反应类型：1)单底物反应：丙酮酸、硫胺素焦磷酸(ThPP)、二价金属离子及ALS或AHAS酶加入到缓冲液中，进行孵育；2)双底物反应：丙酮酸、丁酮酸、硫胺素焦磷酸(ThPP)、二价金属离子及ALS或AHAS酶加入到缓冲液中，进行孵育。6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于：在单底物反应中，以反应体系总体积200-400μL计，则底物丙酮酸的浓度为5.0-10.0mM；二价金属阳离子为Mg2+、Mn2+、Co2+或Zn2+，浓度为2.0-10.0mM；ThPP浓度为0.5-2.0mM，ALS或AHAS用量为0.1-0.5mg/ml；所用缓冲液为40-200mM的Tris-HCl或磷酸盐或柠檬酸或MOPS缓冲液，pH6.0-8.5；孵育温度为30-80℃，孵育时间为0.5-2h；在双底物反应中，反应体系与单底物反应的反应体系相同，底物丙酮酸及底物丁酮酸的浓度分别为1.0-5.0mM。7.一种对乙酰乳酸合酶(ALS)/乙酰羟酸合酶(AHAS)催化反应底物的转化率的检测方法，包括以下步骤：1)催化反应中未转化的底物的衍生化：酶催化反应完成后，反应混合物沸水中加热3分钟终止反应，10000rpm下离心5分钟，取上清50-100μL加入到...
【专利技术属性】
技术研发人员：高文运，李恒，刘慧，高凤，王昕洁，刘楠，
申请(专利权)人：西北大学，
类型：发明
国别省市：陕西,61
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