一种畜禽粪便中45种抗生素同时精准检测的方法技术

本发明专利技术公开了一种畜禽粪便中45种抗生素同时精准检测的方法，包括：建立抗生素标准曲线、样品检测等内容。新方法通过筛选得到提取液成分与比例，使得不同性质抗生素同时被提取，实现更多种抗生素同时精准检测。在检测时，降低了检测时45种抗生素整体的RSD，显著降低检测误差，提高了检测的精度。新方法中，在12min内实现了对五大类抗生素中的45种抗生素分离检测，具有可操作性强、高效、快速和准确度高等特点。

【技术实现步骤摘要】
一种畜禽粪便中45种抗生素同时精准检测的方法
本专利技术属于固体废弃物资源化
，涉及一种畜禽粪便中45种抗生素的同时精准检测方法。
技术介绍
我国是养殖大国，也是抗生素消耗大国，据报道，2013年我国抗生素总使用量约为16.2万吨（约为美国总使用量的9倍），其中52%用于畜禽养殖业。由此可见，我国兽用抗生素消耗已占据举足轻重的地位。兽用抗生素使用后30%～90%随着畜禽粪尿排出体外，且大部分以母体形式存在。而我国，畜禽粪便的主要利用方式为农田利用，因此，畜禽粪便中的抗生素残留又会对土壤、水体等造成二次污染，从而危害人类健康。建立畜禽粪便中多种抗生素同时精准检测方法对研究其环境归趋行为和生态风险提供技术支持。畜禽粪便中基质复杂，有机物对抗生素的检测造成严重影响。目前关于抗生素残留的检测主要包括微生物法、免疫分析法、毛细管电泳法、高效液相色谱以及液相-质谱联用技术等，其中大部分方法分辨率和灵敏度差、特异性差。然而高效液相色谱-质谱联用技术对抗生素残留提供的信息最多，既可进行抗生素的准确定量又可进行准确定性分析，灵敏度高，可实现畜禽粪便中多种抗生素同时精准检测。例如，“利用高效液相色谱同时检测粪便中多种抗生素的方法”《CN105548392A》针对粪便中11种抗生素建立检测方法；“一种定量检测鸡粪中氟喹诺酮类的方法”《CN103969362A》针对鸡粪中9种氟喹诺酮类抗生素建立检测方法。相关文献中也有类似报道，例如，Feng等建立了畜禽粪便中13种兽用抗生素的精准检测方法。然而，随着兽用抗生素种类越来越多，以及不同养殖户选择抗生素的习惯不同，畜禽粪便中抗生素残留种类越来越多，并且不同种类抗生素的物理化学性质差异较大，这对多种抗生素的同时精准检测提出了挑战。因此，亟需建立针对更广泛种类抗生素的精准检测方法，目前针对45种（5大类）兽用抗生素的同时精准检测方法未见报道。
技术实现思路
本专利技术公开了一种畜禽粪便中45种抗生素的同时精准检测方法，其特征在于按如下的步骤进行：1、建立抗生素标准曲线（1）45种抗生素标准品：盐酸土霉素、多西环素、金霉素、去甲基金霉素、四环素、氧氟沙星、恩诺沙星、二氟沙星、司帕沙星、萘啶酸、氟罗沙星、盐酸洛美沙星、沙拉沙星、环丙沙星、达氟沙星、依诺沙星、氟甲喹、西诺沙星、奥比沙星、噁喹酸、诺氟沙星、磺胺二甲异嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺噁唑、磺胺吡啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶钠、磺胺二甲（基）嘧啶、磺胺甲噻二唑、磺胺邻二甲氧嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺异噁唑、苯酰磺胺、磺胺间二甲氧嘧啶、磺胺喹噁啉、磺胺对甲氧嘧啶、罗红霉素、克拉霉素、阿奇霉素、螺旋霉素、替米考星、苯唑西林、青霉素G、氯唑西林，纯度均大于等于95%；（2）45种抗生素标准储备溶液：分别称取适量标准品，分别用对应的溶剂溶解，其中β-内酰胺类用乙腈:水=1:3溶解，其他的用甲醇溶解，配制成100mg/L，置于冰箱-20℃保存；（3）标准工作溶液：准确称取抗生素标准储备液适量，用甲醇配制成不同浓度系列的混合标准工作溶液，用时现配；（4）高效液相色谱条件为：色谱柱：C18柱，ACQUITYUPLCHSST3，2.1（内径）×100mm，1.8μm或相当；流动相：A组分是超纯水（含1‰甲酸）；B组分是乙腈；梯度洗脱程序：0～1.5min,90%A；1.5～8min,90～30%A；8～8.1min,30～90%A；8.1～12min,90%A；流速：0.3mL/min；进样量：5μL；（5）所述质谱条件为：离子源：电喷雾离子源（ESI）；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测（MRM）；离子源温度：150℃；脱溶剂气温度为500℃；脱溶剂气和锥孔气为氮气；碰撞气为高纯氩气；2、样品检测（1）称取畜禽粪便鲜样，冷冻干燥，粉碎过2mm筛；（2）加入质量体积比为1:20（g:mL）的Tris溶液、乙酸盐溶液、乙腈、甲醇、EDTA-Mcllvaine混合提取液，旋涡混匀；其中混合提取液Tris溶液：乙酸盐溶液：乙腈：甲醇：EDTA-Mcllvaine缓冲液=1:1:1:1:1～1:1:1:1:2（体积比），涡旋混合时间为30s～5min；Tris溶液：将50mL的0.1mol/LTris碱溶液与45.7mL的0.1mol/LHCl混合，加水将体积调至100mL；乙酸盐溶液：取醋酸铵25g，加水25mL溶解后，加7mol/L盐酸溶液38mL，用2mol/L盐酸溶液或5mol/L氨溶液准确调节pH值至3.5，用水稀释至100mL，即得；EDTA-Mcllvaine：称取一定量的Na2HPO4、Na2EDTA和柠檬酸，分别配制成0.2、0.4和0.2mol/L的溶液，柠檬酸溶液与Na2HPO4溶液按照体积比8:5混合，配制成Mcllvaine缓冲液；1LMcllvaine缓冲液与Na2EDTA溶液体积比1:1混合，得到0.1mol/L的Na2EDTA-MCllvaine提取液；（3）超声波处理15min，以3000～10000rpm离心5～15min获取上清液，在上述提取液中重复提取2-3次，合并上清液，待用；（4）提取获得的上清液加入MgCl2和蛭石，体积比为30:1:1(mL:g:g)，混合均匀后，将其置于-20℃冷冻1h，过滤获得液体部分；（5）将上述液体通过watersPRiMEHLB固相萃取柱，速度0.5-1mL/min，抽真空5min，用6ml酸性甲醇、乙腈混合液洗脱柱子，其中甲醇:乙腈为3:7（含1‰甲酸），收集洗脱液；（6）第5步中将洗脱液于低于40℃下氮气吹干，用1.0mL甲醇:水（1:1，v/v）加1‰甲酸复溶，0.22μm有机滤膜过滤，用液相色谱-质谱/质谱仪测定；所述高效液相色谱条件为：色谱柱：C18柱，ACQUITYUPLCHSST3，2.1（内径）×100mm，1.8μm或相当；流动相：A组分是超纯水（含1‰甲酸）；B组分是乙腈；梯度洗脱程序见表1；流速：0.3mL/min；进样量：5μL。梯度洗脱程序步骤时间（min）流速（ml/min）组分A(%)组分B(%)100.3901021.50.39010380.3307048.10.390105120.39010所述质谱条件为：离子源：电喷雾离子源（ESI）；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测（MRM）；离子源温度：150℃；脱溶剂气温度为500℃；脱溶剂气和锥孔气为氮气；碰撞气为高纯氩气。本专利技术进一步公开了畜禽粪便中45种抗生素同时精准检测方法，在降低检测45种抗生素整体的RSD，降低检测误差，提高检测精度方面的应用。实验结果显示，采用本专利技术的方法，可以在12min内实现了对五大类抗生素中的45种抗生素的分离检测，具有可操作性强、高效、快速和准确度高等特点。本专利技术主要解决了不同种类抗生素同时精准检测问题，使得45种抗生素实现同时精准检测，重点考察了样品中抗生素提取时，所使用不同提取液产生的不同提取效果，主要的难点在于：一是，筛选得到提取液的组分和比例，使45种抗生素同时高效提取；二是，在检测第（4）步骤中需要在提取获得的上清液加入MgCl2和蛭石，才能提高检测效率。本专利技术更加详细的描述如下：一、材料与方法1、建立抗生素标准曲线（1）45种抗生素本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种畜禽粪便中45种抗生素同时精准检测的方法，其特征在于按如下的步骤进行：一、建立抗生素标准曲线（1）45种抗生素标准品：盐酸土霉素、多西环素、金霉素、去甲基金霉素、四环素、氧氟沙星、恩诺沙星、二氟沙星、司帕沙星、萘啶酸、氟罗沙星、盐酸洛美沙星、沙拉沙星、环丙沙星、达氟沙星、依诺沙星、氟甲喹、西诺沙星、奥比沙星、噁喹酸、诺氟沙星、磺胺二甲异嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺噁唑、磺胺吡啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶钠、磺胺二甲（基）嘧啶、磺胺甲噻二唑、磺胺邻二甲氧嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺异噁唑、苯酰磺胺、磺胺间二甲氧嘧啶、磺胺喹噁啉、磺胺对甲氧嘧啶、罗红霉素、克拉霉素、阿奇霉素、螺旋霉素、替米考星、苯唑西林、青霉素G、氯唑西林，纯度均大于等于95%；（2）45种抗生素标准储备溶液：分别称取适量标准品，分别用对应的溶剂溶解，其中β‑内酰胺类用乙腈:水体积比为1:3溶解，其他的用甲醇溶解，配制成100 mg/L，置于冰箱‑20 ℃保存；（3）标准工作溶液：准确称取抗生素标准储备液适量，用甲醇配制成不同浓度系列的混合标准工作溶液，用时现配；（4）高效液相色谱条件为：色谱柱：C18柱，ACQUITY UPLC HSS T3，2.1（内径）×100mm，1.8μm 或相当；流动相：A组分是超纯水（含1‰甲酸）；B组分是乙腈；梯度洗脱程序：0～1.5 min, 90% A；1.5～8 min, 90‑30% A；8～8.1min, 30～90% A；8.1～12 min, 90% A；流速：0.3 mL/min；进样量：5 μL；（5）所述质谱条件为：离子源：电喷雾离子源（ESI）；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测（MRM）；离子源温度：150 ℃；脱溶剂气温度为500 ℃；脱溶剂气和锥孔气为氮气；碰撞气为高纯氩气；二、样品检测（1）称取畜禽粪便鲜样，冷冻干燥，粉碎过2 mm筛；（2）加入质量体积比为1:20（g:mL）的Tris溶液、乙酸盐溶液、乙腈、甲醇、EDTA‑Mcllvaine混合提取液，旋涡混匀；其中混合提取液Tris溶液：乙酸盐溶液：乙腈：甲醇：EDTA‑Mcllvaine=1:1:1:1:1～1:1:1:1:2（体积比），蜗旋混合时间为30 s～5 min；Tris溶液：将50mL的0.1mol/L Tris碱溶液与45.7mL的0.1 mol/L HCl混合，加水将体积调至100 mL；乙酸盐溶液：取醋酸铵25g，加水25mL溶解后，加7mol/L盐酸溶液38mL，用2mol/L盐酸溶液或5mol/L氨溶液准确调节PH值至3.5，用水稀释至100mL，即得；EDTA‑Mcllvaine：称取一定量的Na2HPO4、Na2EDTA和柠檬酸，分别配制成0.2、0.4和0.2mol/L的溶液，柠檬酸溶液与Na2HPO4溶液按照体积比8:5混合，配制成Mcllvaine缓冲液；1L Mcllvaine缓冲液与Na2EDTA溶液体积比1:1混合，得到0.1mol/L的Na2EDTA‑Mcllvaine提取液；（3）超声波处理15 min，以3000～10000 rpm离心5～15 min获取上清液，在上述提取液中重复提取2‑3次，合并上清液，待用；（4）提取获得的上清液加入MgCl2和蛭石，体积比为30:1:1(mL:g:g)，混合均匀后，将其置于‑20℃冷冻1h，过滤获得液体部分；（5）将上述液体通过waters PRiME HLB固相萃取柱，速度0.5‑1 mL/min，抽真空5 min，用6 mL酸性甲醇、乙腈混合液洗脱柱子，其中甲醇:乙腈为3:7（含1‰甲酸），收集洗脱液；（6）第5步中将洗脱液于低于40 ℃下氮气吹干，用1.0 mL甲醇:水（1:1，v/v）加1‰甲酸复溶，0.22 μm有机滤膜过滤，用液相色谱‑质谱/质谱仪测定；所述高效液相色谱条件为：色谱柱：C18柱，ACQUITY UPLC HSS T3，2.1（内径）×100 mm，1.8 μm 或相当；流动相：A组分是超纯水（含1‰甲酸）；B组分是乙腈；梯度洗脱程序见表1；流速：0.3 mL/min；进样量：5 μL；梯度洗脱程序...

【技术特征摘要】
1.一种畜禽粪便中45种抗生素同时精准检测的方法，其特征在于按如下的步骤进行：一、建立抗生素标准曲线（1）45种抗生素标准品：盐酸土霉素、多西环素、金霉素、去甲基金霉素、四环素、氧氟沙星、恩诺沙星、二氟沙星、司帕沙星、萘啶酸、氟罗沙星、盐酸洛美沙星、沙拉沙星、环丙沙星、达氟沙星、依诺沙星、氟甲喹、西诺沙星、奥比沙星、噁喹酸、诺氟沙星、磺胺二甲异嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺噁唑、磺胺吡啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶钠、磺胺二甲（基）嘧啶、磺胺甲噻二唑、磺胺邻二甲氧嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺异噁唑、苯酰磺胺、磺胺间二甲氧嘧啶、磺胺喹噁啉、磺胺对甲氧嘧啶、罗红霉素、克拉霉素、阿奇霉素、螺旋霉素、替米考星、苯唑西林、青霉素G、氯唑西林，纯度均大于等于95%；（2）45种抗生素标准储备溶液：分别称取适量标准品，分别用对应的溶剂溶解，其中β-内酰胺类用乙腈:水体积比为1:3溶解，其他的用甲醇溶解，配制成100mg/L，置于冰箱-20℃保存；（3）标准工作溶液：准确称取抗生素标准储备液适量，用甲醇配制成不同浓度系列的混合标准工作溶液，用时现配；（4）高效液相色谱条件为：色谱柱：C18柱，ACQUITYUPLCHSST3，2.1（内径）×100mm，1.8μm或相当；流动相：A组分是超纯水（含1‰甲酸）；B组分是乙腈；梯度洗脱程序：0～1.5min,90%A；1.5～8min,90-30%A；8～8.1min,30～90%A；8.1～12min,90%A；流速：0.3mL/min；进样量：5μL；（5）所述质谱条件为：离子源：电喷雾离子源（ESI）；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测（MRM）；离子源温度：150℃；脱溶剂气温度为500℃；脱溶剂气和锥孔气为氮气；碰撞气为高纯氩气；二、样品检测（1）称取畜禽粪便鲜样，冷冻干燥，粉碎过2mm筛；（2）加入质量体积比为1:20（g:mL）的Tris溶液、乙酸盐溶液、乙腈、甲醇、EDTA-Mcllvaine混合提取液，旋涡混匀；其中混合提取液Tris溶液：乙酸盐溶液：乙腈：甲醇：EDTA-Mcllvaine=1:1:1:1:1～1:1:1:1:2（体积比），蜗旋混合时间为30s～...

【专利技术属性】
技术研发人员：支苏丽，张克强，周婧，
申请(专利权)人：农业部环境保护科研监测所，
类型：发明
国别省市：天津,12