慢病毒载体在CAR-T细胞中的整合位点分析方法及引物技术

本发明专利技术公开了一种慢病毒载体在CAR‑T细胞中的整合位点分析方法及应用于该方法的引物序列。所述方法是使用慢病毒载体的LTR区特异引物做单向PCR来捕获插入到基因组上的LTR区，接着用两套接头引物作巢式PCR扩增得到整合位点序列。本发明专利技术的方法不依赖于限制性内切酶，而且灵敏度高、特异性和稳定性好，可用于复杂或微量样本中慢病毒载体整合位点的克隆，尤其是临床样本及临床前模型样本。通过PCR的手段捕获得到整合位点序列后，再用生物信息学方法对捕获的整合位点在基因组上进行定位分析，即可对慢病毒载体在宿主细胞的基因组中发生的整合进行安全性评价。

【技术实现步骤摘要】
慢病毒载体在CAR-T细胞中的整合位点分析方法及引物
本专利技术涉及基因工程
，具体涉及一种慢病毒载体在CAR-T细胞中的整合位点分析方法，以及用于该方法的引物序列。
技术介绍
慢病毒(HIV-1，HIV-2)是逆转录病毒中的一类，现有的慢病毒载体来源于多个物种，包括人类免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiencyvirus，HIV)、猴免疫缺陷病毒(simianimmunodeficiencyvirus，SIV)等。它是以慢病毒基因组为基础，去除其表达非必需的基因，代之以治疗基因构建而成的。慢病毒整合到宿主细胞的染色体上可以长期稳定表达，并且与其他逆转录病毒(例如腺病毒)相比，慢病毒不但能感染分裂期细胞，而且还能感染非分裂期的细胞，基于以上优点，慢病毒载体(lentiviralvector)作为外源基因转移载体已广泛用于临床基因治疗。CAR-T指嵌合抗原受体(chimericantigenreceptor，CAR)T细胞，是将嵌合抗原受体导入T细胞中，T细胞表达抗体单链的可变区(scFv)并联合T细胞信号区，即能够调控T细胞的功能和特异性，靶向杀伤肿瘤细胞。先将患本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.慢病毒载体在CAR‑T细胞中的整合位点分析方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)根据慢病毒载体5’LTR区设计特异性扩增引物LTRI，LTRI的5’端用生物素标记；以CAR‑T基因组DNA为模板，作单向线性PCR扩增，用链霉素磁珠收集扩增产物；(2)设计一条5’端磷酸化，3’端双脱氧的单链DNAlinker(ssLC)，用RNA连接酶将单链DNAlinker的5’端与步骤(1)的扩增产物3’端连接；(3)第一轮PCR扩增：根据DNAlinker序列和慢病毒载体5’端LTR区设计第一对引物，上游引物LTRII，下游引物LCI，以步骤(2)的连接产物为模板进行PCR扩增；(4)第二轮PCR扩增...

【技术特征摘要】
1.慢病毒载体在CAR-T细胞中的整合位点分析方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)根据慢病毒载体5’LTR区设计特异性扩增引物LTRI，LTRI的5’端用生物素标记；以CAR-T基因组DNA为模板，作单向线性PCR扩增，用链霉素磁珠收集扩增产物；(2)设计一条5’端磷酸化，3’端双脱氧的单链DNAlinker(ssLC)，用RNA连接酶将单链DNAlinker的5’端与步骤(1)的扩增产物3’端连接；(3)第一轮PCR扩增：根据DNAlinker序列和慢病毒载体5’端LTR区设计第一对引物，上游引物LTRII，下游引物LCI，以步骤(2)的连接产物为模板进行PCR扩增；(4)第二轮PCR扩增：根据DNAlinker序列和慢病毒载体5’端LTR区设计第二对引物，上游引物LTRIII，下游引物LCII，以步骤(3)的扩增产物为模板进行PCR扩增；(5)步骤(4)的扩增产物进行文库构建，测序分析，即可得出慢...

【专利技术属性】
技术研发人员：张同存，顾潮江，高阳，
申请(专利权)人：武汉波睿达生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北,42