全血样本长期保存方法及RNA提取方法技术

本发明专利技术公开了一种全血样本长期保存方法及RNA提取方法，将采集到的新鲜全血立即和5～15倍体积的TRIzol试剂混匀，均质化后于‑80℃冰箱中保存，保存一段时间后对保存的全血‑TRIzol混合体系提取总RNA。本发明专利技术实现了人全血无需分离血浆或裂解红细胞，也无需对全血进行分装，而是直接均质化后长期保存，并提取出纯度和完整性很高的高质量总RNA。

【技术实现步骤摘要】
全血样本长期保存方法及RNA提取方法
本专利技术涉及一种血液样本保存和RNA提取方法，尤其是涉及一种用于提取RNA的人全血样本的长期保存和RNA提取的方法。
技术介绍
随着21世纪初人类基因组计划(HumanGenomeProject)的完成，生命科学进入后基因组时代，转录组学、蛋白组学和代谢组学等新的组学研究应运而生。在中心法则中，RNA是连接DNA与蛋白质的桥梁，反映了细胞功能状态的动态变化。转录组学从RNA水平上研究基因表达情况，在探究疾病发生和发展的生物机制中发挥了重要作用。近年来在临床医学、流行病学、分子生物学等领域得到了越来越多的应用。RNA的提取是RNA-seq、微阵列检测、RT-PCR、Northernblot等实验的基础，RNA的质量对RNA研究的结果有很大的影响，只有提取出完整性较好、纯度较高的RNA才能进行下游各种分析。在人的基因表达研究中，全血是一种侵入性较低且有价值的RNA来源，常被用来提取RNA。与DNA不同，RNA为单链结构，RNA核糖残基的2'和3'位置带有羟基，化学性质活泼、结构不稳定。同时由于内源性和外源性的RNA酶无处不在，使得RNA在保存、运输、提取等过程中非常容易降解，给RNA的提取带来了很大的困难。因此，大部分研究在全血收集后，需要尽快对RNA进行提取。目前人全血RNA提取方法主要有TRIzol试剂法、PAXgene血液RNA试剂盒法等。PAXgene血液RNA试剂盒价格非常昂贵，且需配套使用PAXgene静脉真空采血管，对于样本量较大的研究来说，成本较高、难以推广。而TRIzol试剂法是一种经典的RNA抽提方法，操作简单且价格相对较低。但现有的TRIzol试剂法还存在以下不足：1.全血RNA含量极少，传统TRIzol试剂法需要从全血中先分离出有核细胞，操作较为繁琐且会损失部分白细胞，使得此方法对样本的需求量较大，一般需要2.5mL全血。2.全血需要分装到不含RNA酶的1.5mL离心管进行预处理，经离心、分离血浆、得到白膜层并裂解红细胞后得到白细胞，或先进行红细胞裂解后得到白细胞。对于在短时间内收集大量生物样本的研究而言工作量非常繁重。3.由于RNA自身结构及RNA酶等因素的影响，现有技术要求采血后尽快提取RNA，全血保存时间增长，RNA降解风险增加。而临床生物样本库、流行病学等研究的生物样本往往需要长期保存，根据研究需要再进行RNA的提取和后续分析，目前亟需长期保存用于提取RNA的全血样本的方法。4.现有技术提取出全血RNA的纯度较低。提取过程大多在不含RNA酶的1.5mL离心管中进行，体系较小，洗涤等过程中可能导致碳水化合物(糖类)、盐类或有机溶剂残留，使得OD260/230(指示RNA纯度的指标)较低。对于全血量多的情况，需要分成若干管进行提取，增加了操作步骤和时间，容易引入影响RNA质量的风险因素。5.在RNA洗涤后的晾干过程中，自然晾干时间较长，使得RNA暴露于环境中RNA酶的可能性增加，从而导致降解风险增大。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种能够长期保存用于提取RNA的全血样本的简单易行的方法，进一步的，提供对经该方法长期保存的样品进行RNA提取的方法，获得具有高完整性和高纯度的总RNA。为实现上述技术目的，本专利技术的技术方案如下：将采集到的新鲜全血立即与5～15体积的TRIzol试剂充分混匀，均质化后于-80℃冰箱中保存。此方法可实现对用于提取RNA的全血样本的长期保存。优选的，将采集的新鲜全血立即与10倍体积的TRIzol试剂混匀，然后在-80℃冰箱中保存。上述方法在采血后无需分离血浆、裂解红细胞，也无需将全血分装到若干个不含RNA酶的1.5mL离心管中。将新鲜全血和TRIzol试剂在不含RNA酶的容器(如不含RNA酶的15mL离心管)中混匀，形成全血-TRIzol混合体系。TRIzol试剂是RNA的释放剂和保护剂，相较于直接冻存全血，此方法使得RNA与全血内源RNA酶相隔离，从而能保护RNA不被降解。上述方法可以有效保存用于提取RNA的全血样本一年以上，后续对全血-TRIzol混合体系提取总RNA，能够得到高完整性和高纯度的总RNA。本专利技术提供的全血-TRIzol混合体系提取总RNA的方法，包括以下步骤：1)将全血-TRIzol混合体系在4℃解冻，转移至不含RNA酶的离心管中，加入氯仿振荡混匀，室温孵育约3～5分钟，然后在4℃离心进行相分离，取上层水相于新的不含RNA酶的离心管中；2)在步骤1)取得的水相中加入-20℃预冷的异丙醇，轻轻上下颠倒混匀后，在-20℃条件下孵育20～30分钟，然后在4℃离心，离心管底部和/或侧壁形成凝胶样总RNA沉淀，弃去上清；3)用焦碳酸二乙酯(Diethypyrocarbonate，DEPC)处理水与无水乙醇配制的75％乙醇溶液重复洗涤总RNA多次；4)晾干总RNA沉淀，然后用DEPC处理水重新溶解总RNA，保存在-80℃冰箱中或进行检测。上述步骤1)中，氯仿的加入量为保存时所加入TRIzol试剂量的20％(体积比)，大力上下振荡离心管0.5～1.5分钟，涡旋振荡10～20秒，室温孵育3分钟，然后将混合体系以12000g转速在4℃条件下离心15～25分钟；离心后，混合体系分离为红色下层(酚-氯仿相)、白色中间层以及无色上层水相，RNA存在于水相中，水相体积约为保存时所加入TRIzol试剂量的60％。上述步骤2)中，预冷异丙醇的加入量为保存时所加入TRIzol试剂量的50％(体积比)，轻轻上下颠倒混匀后，在-20℃条件下孵育20～30分钟，然后以12000g转速在4℃条件下离心20～30分钟，离心后在管底部和/或侧壁形成凝胶样总RNA沉淀。此步骤在15mL离心管中进行。上述步骤3)中，用75％乙醇溶液重复洗涤总RNA三次，第1次洗涤过程：在步骤2)的15mL离心管中加入3mL75％乙醇溶液，轻轻摇动使沉淀重新悬浮，涡旋振荡15秒，以7500g转速在4℃条件下离心8分钟后弃去上清；第2次洗涤过程：加入1mL75％乙醇溶液，将15mL离心管中的RNA沉淀转移至不含RNA酶的1.5mL离心管，涡旋振荡15s，以7500g转速在4℃条件下离心5分钟后弃去上清；第3次洗涤过程：加入1mL75％乙醇溶液，涡旋振荡15秒，以7500g转速在4℃条件下离心5分钟后弃去上清。上述步骤4)中，将弃去上清的装有RNA沉淀的1.5mL离心管以7500g转速在4℃条件下继续离心2分钟后，用20μL移液枪小心吸去多余液体(有利于缩短RNA晾干时间)，再晾干总RNA沉淀。对于根据本专利技术方法从人全血中提取出的总RNA，检测其总量、纯度和完整性，如使用3.0荧光计(LifeTechnologies,CA,USA)对总RNA浓度和总量进行检测，使用分光光度计(IMPLEN,CA,USA)对总RNA纯度进行检测，使用Agilent2100RNANano6000AssayKit(AgilentTechnologies,CA,USA)对总RNA完整性进行评估，经质检合格的RNA样本用于后续分析，如转录组测序、微阵列检测、RT-PCR、Northernblot实验等。相对于现有技术，本专利技术的优势体现在：1.针对传统TRIzol法需要分离有核细胞、本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种长期保存全血样本的方法，将采集到的新鲜全血立即和5～15倍体积的TRIzol试剂混匀，均质化后于‑80℃冰箱中保存。

【技术特征摘要】
1.一种长期保存全血样本的方法，将采集到的新鲜全血立即和5～15倍体积的TRIzol试剂混匀，均质化后于-80℃冰箱中保存。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，将采集到的新鲜全血立即和10倍体积的TRIzol试剂混匀，均质化后于-80℃冰箱中保存。3.一种长期保存并提取全血总RNA的方法，将采集到的新鲜全血立即和5～15倍体积的TRIzol试剂混匀，均质化后于-80℃冰箱中保存，保存一段时间后对保存的全血-TRIzol混合体系提取总RNA，提取步骤包括：1)将全血-TRIzol混合体系在4℃解冻，转移至不含RNA酶的离心管中，加入氯仿振荡混匀，室温孵育3～5分钟，然后在4℃离心进行相分离，取上层水相于新的不含RNA酶的离心管中；2)在步骤1)取得的水相中加入-20℃预冷的异丙醇，轻轻上下颠倒混匀后，在-20℃条件下孵育20～30分钟，然后在4℃离心，离心管底部和/或侧壁形成凝胶样总RNA沉淀，弃上清；3)用焦碳酸二乙酯处理水与无水乙醇配制的75％乙醇溶液重复洗涤总RNA多次；4)晾干总RNA沉淀，然后用焦碳酸二乙酯处理水重新溶解总RNA，保存在-80℃冰箱中或进行检测。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，将采集到的新鲜全血立即和10倍体积的TRIzol试剂混匀。5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤1)中氯仿的加入量为保存时所加入TRIzol试剂量的20％。6.如权利要求3所述的方法，其特征在于，...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱彤，姚媛，陈悟，
申请(专利权)人：北京大学，
类型：发明
国别省市：北京,11