5’S-LNA核苷酸和寡核苷酸制造技术

本发明专利技术涉及式(I)的化合物

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】5’S-LNA核苷酸和寡核苷酸本专利技术涉及在糖环的5’-位上带有硫原子的LNA亚磷酰胺(phosphoramidite)结构单元、用于制备这种结构单元的方法和用于制备包含这种结构单元的寡核苷酸的方法。本专利技术由此特别地涉及式(I)的化合物其中R1是磷酸酯保护基；R2和R4一起形成-CH2O-、-CH2NH-、-CH2S-、-CH2N(ORp)-、-CHCH3O-、-C(CH3)2O-、-CH2C(＝CH2)-、-CHCH3C(＝CH2)-、-CHCH3S-、-CH2NRp-、-CH2CH2O-、-CH2CH2CH2O-、-CH2OCH2-、-CH(CH2OCH3)O-、-CH(CH2CH3)O-或-CH2OCH2O-；R3是二烷基氨基；R5是硫羟基保护基；每个Rp是烷基；且Nu是任选包含被保护的伯氨基基团的核碱基(nucleobase)。使用寡脱氧核苷酸作为治疗剂，其中充分理解的Watson-Crick杂交原理被用于靶向互补RNA链，自1970年代后期开始以来取得了显著进展(P.C.Zamecnik,M.L.Stephenson,PNatlAcadSciUSA1978,75,280-284；S.T.Crooke,Antisensedrugtechnology:principles,strategies,andapplications,第2版,BocaRaton,FL:CRCPress,2008)。随后在合成寡核苷酸中引入了几种类型的化学修饰，以例如延长其半衰期、改善药代动力学、增强RNaseH活性、降低毒性或增强错配区分。最成功的修饰之一是引入硫代磷酸酯键(phosphorothioate)，其中一个非桥连磷酸酯基氧原子被硫原子替代(F.Eckstein,AntisenseandNucleicAcidDrugDevelopment2009,10,117-121)。这种硫代磷酸酯寡脱氧核苷酸显示出增加的蛋白质结合以及明显更高的核溶解降解稳定性，因此血浆、组织和细胞中的半衰期显著高于未修饰的磷酸二酯类似物。这使得研发了第一代寡核苷酸治疗剂，并且打开了例如锁定核酸(LNA)这样的后代修饰的大门。然而，用硫代磷酸酯替代磷酸二酯键在磷原子上产生手性中心。因此，迄今为止所有批准的寡核苷酸治疗剂都是大量非对映异构化合物的混合物，它们具有潜在不同(和可能相反)的生理化学性质。为了降低这种寡脱氧核苷酸的非对映异构体复杂性，硫代磷酸酯内的硫原子理论上可以从非桥接位置之一转移到核糖的桥接5'-位置。这种修饰赋予围绕磷对称的取代模式且因此除去了手性中心，从而降低了分子的非对映异构体复杂性。已经制备了含有这种2',5'-双脱氧-5-巯基结构单元的寡核苷酸(参见R.Cosstick,J.Gaynor,Curr.Org.Chem.2008,12,291-308和其中的参考文献)并检查了在不同的背景下如例如特定地点的裂解(例如K.Jahn-Hofmann,J.W.Engels,Helv.Chim.Acta2004,87,2812-2828)或化学生物学中的机械研究(例如S.R.Das,J.A.Piccirilli,NatChemBiol2005,1,45-52)。然而，它们在治疗环境中的应用，特别是旨在降低硫代磷酸酯寡核苷酸的非对映异构体复杂性的目的，受到的关注较少。此外，这种2',5'-双脱氧-5'-巯基修饰与锁定核酸(LNA)糖部分的组合是完全前所未有的。我们已经惊奇地发现了一种方法，它首次获得在糖环的5'-位置带有硫原子的LNA亚磷酰胺结构单元，并将它们应用于合成修饰的寡核苷酸。因此，本专利技术提供了进入这种5'-巯基修饰的LNA的方法。当包含在寡核苷酸中时，它降低了所得分子的非对映异构体复杂性。在本说明书中，单独或组合的术语“烷基”表示具有1-8个碳原子的直链或支链烷基，特别是具有1-6个碳原子的直链或支链烷基，且更特别地，具有1-3个碳原子的直链或支链烷基。直链和支链C1-C8烷基基团的实例是甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、异构戊基、异构己基、异构庚基和异构辛基，特别是甲基、乙基、丙基、丁基和戊基，且更特别是甲基、乙基、丙基、异丙基、异丁基、叔丁基和异戊基。烷基的具体实例是甲基、乙基、丙基和异丙基。单独或组合的术语“烷氧基”或“烷基氧基”表示式烷基-O-的基团，其中术语“烷基”具有先前给出的含义，如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基和叔丁氧基。特别的“烷氧基”是甲氧基和乙氧基。.单独或组合的术语“卤素”或“卤代”表示氟、氯、溴或碘，特别是氯、溴或碘。术语“卤代”与另一个基团组合时表示用至少一个卤素取代所述基团，特别是取代有一至五个卤素，特别是一至四个卤素，即一个、两个、三个或四个卤素。单独或组合的术语“芳基”表示苯基或萘基基团。单独或组合的术语“羟基”和“羟”表示-OH基团。单独或组合的术语“硫羟基”和“硫羟”表示-SH基团。单独或组合的术语“氨基”表示伯氨基基团(-NH2)、仲氨基基团(-NH-)或叔氨基基团(-N-)。单独或组合的术语“氧基”表示-O-基团。单独或组合的术语“保护基”表示通过为在随后化学反应中得到化学选择性而化学修饰官能团被引入分子的基团。“磷酸酯保护基”是磷酸酯基团的保护基。磷酸酯保护基的实例是2-氰基乙基和甲基。磷酸酯保护基的具体实例是2-氰基乙基。“羟基保护基”是羟基基团的保护基。羟基保护基的实例是乙酰基(Ac)、苯甲酰基(Bz)、苄基(Bn)、β-甲氧基乙氧基甲基醚(MEM)、二甲氧基三苯甲基(或双-(4-甲氧基苯基)苯基甲基)(DMT)、三甲氧基三苯甲基(或三-(4-甲氧基苯基)苯基甲基)(TMT)、甲氧基甲基醚(MOM)、甲氧基三苯甲基[(4-甲氧基苯基)二苯基甲基(MMT)、对-甲氧基苄基醚(PMB)、甲硫基甲基醚、新戊酰基(Piv)、四氢吡喃基(THP)、四氢呋喃(THF)、三苯甲基或三苯基甲基(Tr)、甲硅烷基醚(例如三甲基甲硅烷基(TMS)、叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)、三-异-丙基甲硅烷基氧基甲基(TOM)和三异丙基甲硅烷基(TIPS)醚)、甲基醚和乙氧基乙基醚(EE)。羟基保护基的具体实例是DMT和TMT，特别是DMT。“硫羟基保护基”是硫羟基基团的保护基。硫羟基保护基的实例是“羟基保护基”的那些。术语“离去基团”是指在杂原子键裂解中能够带电子对脱离的分子碎片。离去基团的实例是Cl、Br、I、Ots、OTf或OMs。术语“亲核体”是指能够在反应期间贡献电子对给另一种类以形成化学键的化学种类。术语“核碱基”是指核苷酸的碱基部分并且覆盖天然存在和非天然存在的变体。因此，“核碱基”不仅涵盖已知的嘌呤和嘧啶杂环，而且涵盖其杂环类似物和互变体。核碱基的实例包括但不限于腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、5-甲基胞嘧啶、异胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、6-氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、肌苷、二氨基嘌呤和2-氯-6-氨基嘌呤。如本文所用的术语“核苷酸”是指包含糖部分、碱基部分和共价连接的基团(连接基)的糖苷，所述共价连接的基团例如磷酸酯或硫代磷酸核苷酸间键合连接基，并且覆盖天然存在的核苷酸如DN本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.式(I)的化合物

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.07.27 IN 2016410256691.式(I)的化合物其中R1是磷酸酯保护基；R2和R4一起形成-CH2O-、-CH2NH-、-CH2S-、-CH2N(ORp)-、-CHCH3O-、-C(CH3)2O-、-CH2C(＝CH2)-、-CHCH3C(＝CH2)-、-CHCH3S-、-CH2NRp-、-CH2CH2O-、-CH2CH2CH2O-、-CH2OCH2-、-CH(CH2OCH3)O-、-CH(CH2CH3)O-或-CH2OCH2O-；R3是二烷基氨基；R5是硫羟基保护基；每个Rp是烷基；且Nu是任选地包含被保护的伯氨基的核碱基。2.权利要求1的化合物，其中R1是氰基乙基或甲基。3.权利要求1或2的化合物，其中R2和R4一起形成-CH2O-。4.权利要求1-3任一项的化合物，其中R3是二异丙基氨基。5.权利要求1-4任一项的化合物，其中R5是三苯甲基、4-甲氧基三苯甲基、4,4’-二甲氧基三苯甲基或4,4’,4”-三甲氧基三苯甲基。6.权利要求1-5任一项的化合物，其中每个Rp独立地是甲基、乙基或丙基。7.权利要求1-6任一项的化合物，其中核碱基是腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、5-甲基-胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶。8.权利要求1-7任一项的化合物，其中Nu是(A)、(B)、(C)或(D)其中R6是氢或所连接的氨基的保护基。9.权利要求的8的化合物，其中氨基的保护基是苯甲酰基、二甲基甲酰胺、乙酰基或异丁酰基。10.权利要求1-9任一项的化合物，其中Nu是(A1)、(B1)或(C1)11.用于制备如权利要求1-10任一项中所定义的式(I)化合物的方法，包括使式(II)的化合物在P(R3)2OR1和寡核苷酸合成活化剂存在下反应，其中R1至R5和Nu如权利要求1-10任一项中所定义。12.权利要求11的方法，其中权利要求11中所定义的式(II)化合物如下获得：使式(III)的化合物在R5X1和碱存在下反应，其中R2、R4、R5和Nu如权利要求1、3和5-10任一项中所定义，且其中X1是离去基团。13.权利要求12的方法，其中权利要求12中所定义的式(III)化合物如下获得：水解式(IV)的化合物其中R7是烷基、芳基、芳基烷基、取代的芳基或取代的芳基烷基，其中取代的芳基和取代的芳基烷基是在芳基上被1-3个取代基取代的芳基和芳基烷基，所述取代基独立地选自烷基、烷氧基和卤素；且其中R2、R4和Nu如权利要求1、3和6-10任一项中所定义。14.权利要求13的方法，其中R7是苯基。15.权利要求13或14的方法，其中权利要求13中所定义的式(IV)化合物如下获得：使式(V)化合物在R7COSH、膦和脱水剂存在下反应，其中R7如权利要求13或14中所定义，且其中R2、R4和Nu如权利要求1、3和6-10任一项中所定义。16.权利要求15的方法，其中式(V)的化合物通过除去式(VI)化合物的羟基保护基R5得到，其中R5是羟基保护基，且其中R2、R4和Nu如权利要求1、3和6-10任一项中所定义。17.权利要求11的方法，其中权利要求11中所定义的式(II)化合物通过使式(VII)化合物在碱、亲核体和式(VIII)化合物存在下反应得到，其中R8是离去基团；R9是烷基；且R2、R4、R5和Nu如权利要求1、3和5-10任一项中所定义。18.权利要求17的方法，其中权利要求17中所定义的式(VII)化合物通过使权利要求15中所定义的式(V)化合物在R8X2和非亲核碱存在下反应得到，其中X2是离去基团，且R8是能够与式(V)化合物的5’羟基氧原子一起形成离去基团的基团。19.权利要求17或18的方法，其中权利要求17中所定义的式(VIII)化合物通过使R5X3在R9C(O)SH存在下反应得到，其中R5如权利要求1或5中所定义，R9如权利要求17中所定义，且X3是离去基团。20.权利要求11-19任一项的方法，其中寡核苷酸合成活化剂是唑类。21.权利要求11-20任一项的方法，其中寡核苷酸合成活化剂是1H-四唑、5-硝基苯基-1H-四唑(NPT)、5-乙硫基-1H-四唑(ETT)、5-苄硫基-1H-四唑(BTT)、5-甲硫基-1H-四唑(MTT)、5-巯基-四唑(MCT)或4,5-二氰基咪唑(DCI)。22.权利要求17-21任一项的方法，其中亲核体是NaOH、KOH、NaOMe、KOMe、甲胺或NH3。23.权利要求15-22任一项的方法，其中脱水剂是偶氮二甲酸二乙酯或偶氮二甲酸二异丙酯。24.权利要求12-23任一项的方法，其中膦是三苯...

【专利技术属性】
技术研发人员：K·布莱谢尔，J·杜施梅尔，G·萨哈，J·A·沙科赫，
申请(专利权)人：罗氏创新中心哥本哈根有限公司，
类型：发明
国别省市：丹麦,DK