一种膜联蛋白V的应用制造技术

本发明专利技术属于生物技术领域，具体公开了一种膜联蛋白V在制备延缓糖尿病进程药物中的应用，具体包括：制备改善糖尿病生理指标和代谢状况，改善糖尿病模型胰岛素信号通路，改善糖尿病肝脏、胰腺和肾脏的病理变化，改善糖尿病血清肌酐和尿素氮水平，预防糖尿病肾脏并发症或肾功能损害的药物中的应用，以及在保护胰岛素瘤细胞免于糖尿病诱导剂链脲佐菌素导致的细胞凋亡中的应用。

【技术实现步骤摘要】
一种膜联蛋白V的应用
本专利技术属于生物医药
，具体涉及一种膜联蛋白V在制备延缓糖尿病进程药物中的应用。
技术介绍
糖尿病是一种严重威胁人类健康的内分泌代谢性慢性病，近几年，糖尿病的发病率逐渐上升，其特征为持续性血糖升高。若高血糖患者得不到有效控制则会引发感染及多器官组织受损，免疫功能降低，健康受到极大的威胁。采用链脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)诱导高血糖动物模型是目前常用的糖尿病研究模型。膜联蛋白V(AnnexinV)属于磷脂结合蛋白的膜联蛋白家族成员。膜联蛋白家族蛋白以依赖Ca2+的方式与磷脂结合。磷酯酰丝氨酸(phosphatidylserine，PS)和溶血磷脂酰胆碱(lysophosphatidylcholine，LPC)参与凋亡和坏死细胞的清除。膜联蛋白V被首次发现是作为体内抗血栓活性的抗凝血蛋白，膜联蛋白V与凋亡细胞外翻的PS结合可抑制促凝血和促炎症活性。迄今为止，许多学者发现了膜联蛋白V的其它生物学特性，包括Ca2+通道活性，调节磷脂酶A2，抑制凋亡细胞的吞噬作用，抗肿瘤免疫和免疫调节作用等。尽管目前对膜联蛋白V的研究较多，但其生理功能仍有待于研究。LuisE.Munoz及其同事发现，膜联蛋白V缺陷型小鼠与野生(WT)小鼠相比，几乎没有迟发型超敏反应(DTH)，表明内源性膜联蛋白V可增加对死亡细胞的免疫应答。BenjaminFrey和他的同事同样证明内源性膜联蛋白V作为一种炎症蛋白影响坏死细胞的吞噬作用，可以调节对同种异体细胞的免疫反应。然而，膜联蛋白V与糖尿病之间是否存在关联尚不清楚。
技术实现思路
本专利技术的目的在于，提供一种膜联蛋白V在制备延缓糖尿病进程的药物中的应用。本专利技术不仅发现利用膜联蛋白V制备的制剂在体内对糖尿病有保护作用，而且在体外也发现其能减少STZ对胰岛素瘤细胞的损伤作用，同时还发现了利用膜联蛋白V制备的制剂对糖尿病肾脏并发症或肾功能的损害具有预防作用。另外，还研究了膜联蛋白V在制备延缓糖尿病进程药物中的应用。优选地，所述的膜联蛋白V在制备改善糖尿病生理指标和代谢状况的药物中的应用。优选地，所述的糖尿病生理指标和代谢状况为禁食血糖、体重、血清胰岛素水平、葡萄糖耐量测试、食物摄入量、摄水量和尿量。优选地，所述的膜联蛋白V在制备改善糖尿病模型胰岛素信号通路的药物中的应用。优选地，所述的膜联蛋白V在制备改善糖尿病肝脏、胰腺和肾脏的病理变化的药品中的应用。优选地，所述的膜联蛋白V在制备改善糖尿病血清肌酐和血尿素氮水平的药物中的应用。优选地，所述的膜联蛋白V的应用在制备预防糖尿病肾脏并发症或肾功能损害的药物中的应用。优选地，所述的膜联蛋白V在制备与常规糖尿病治疗或预防药物联合运用的延缓糖尿病进程药物中的应用。优选地，所述的膜联蛋白V在保护胰岛素瘤细胞免于糖尿病诱导剂链脲佐菌素导致的细胞凋亡中的应用。另外，还研究了利用常规制剂方法进行膜联蛋白V的制剂，并评价所制备的制剂在延缓糖尿病进程中的应用。本专利技术产生的有益效果为：(1)膜联蛋白V及其制剂能显著降低糖尿病模型的血糖水平、糖耐量实验(IPGTT)和血清胰岛素水平，体重增加；使得糖尿病模型小鼠的代谢状况如24h食物摄入量，摄水量和尿量显著降低。从而证实，膜联蛋白V及其制剂显著改善糖尿病生理指标和代谢状况。(2)通过评估膜联蛋白V及其制剂对胰岛素信号传导途径的影响，结果发现，膜联蛋白V及其制剂处理组血糖水平下降，可能是由于胰岛素信号传导途径的增强。(3)经膜联蛋白V及其制剂处理后，STZ诱导的高血糖小鼠的体内实验显示，肾脏的病理病变显著变轻，血清中肌酐和尿素氮含量减少，表明膜联蛋白V及其制剂可通过降低血清肌酐(Scr)和血尿素氮(BUN)对肾功能起到保护作用。膜联蛋白V及其制剂在延迟STZ诱导的糖尿病发作以及肾功能中发挥保护作用。(4)体外实验中显示，膜联蛋白V制剂可以显著保护胰岛素瘤细胞免于糖尿病诱导剂链脲佐菌素导致的细胞凋亡。附图说明以下图中数据采用平均值±S.E.M分析(每组8只样本)；其中#表示P<0.05，有统计学差异(与对照组比较)；##表示P<0.01，有显著统计学差异(与对照组比较)；##表示P<0.001，有及其显著统计学差异(与对照组比较)；*表示P<0.05，有统计学差异(与模型组比较)；**表示P<0.01，有显著统计学差异(与模型组比较)；***表示P<0.001，有及其显著统计学差异(与模型组比较)。图1A为各组小鼠禁食6h的空腹血糖水平随注射STZ后的时间变化趋势图；图1B为各组小鼠禁食6h的体重随注射STZ后的时间变化趋势图；图1C为膜联蛋白V处理后12周时小鼠的空腹血清胰岛素水平图。图2.膜联蛋白V对体内葡萄糖水平平衡的影响趋势图；图3A为小鼠注射STZ后4周，8周，12周的24小时食物摄入量随STZ注射后的时间变化趋势图；图3B为小鼠注射STZ后4周，8周，12周的用水量随STZ注射后的时间变化趋势图；图3C为小鼠注射STZ后4周，8周，12周的尿量随STZ注射后的时间变化趋势图。图4.膜联蛋白V对各组小鼠肝脏(A)和胰腺(B)形态学变化的影响病理学显微图(HE染色；20×10)。图5.膜联蛋白对肝脏胰岛素信号通路的影响图；其中p-IRS1(A)，pGSK-3β(B)和pAKT(C)的肝脏相对蛋白水平分别标准化为IRS1，GSK-3β和AKT。图6A为用苏木精-伊红(HE)染色(20×10)的肾切片的病理结构显微照片；图6B为STZ诱导的小鼠血清尿氮素水平图；图6C为STZ诱导的小鼠血清肌酐水平图。图7A为胰岛素瘤细胞损伤模型图；图7B为不同浓度的膜联蛋白V对胰岛素瘤细胞中增殖的影响图；图7C为不同浓度的膜联蛋白V对STZ(1μM，24h)刺激的胰岛素瘤细胞增殖的影响图。具体实施方式下面结合具体实施方式，对本专利技术作进一步的详细说明。实施例1(1)膜联蛋白V的表达和制剂在BL21(DE3)大肠杆菌中表达的重组膜联蛋白V，通过亲和层析和离子交换层析、获得纯化的重组膜联蛋白V；所有制备的溶液均由无菌无内毒素水制成；使用BCA试剂盒测量蛋白质浓度；纯化后，通过SDS-PAGE电泳分析蛋白产物的纯度，超过98％。然后或者以溶液形式的水剂、或者复溶性状好的冻干粉剂。后续研究证明：不同制剂形式的重组膜联蛋白的各种活性相当。(2)诱导实验性高血糖模型将50只8-9周龄雄性B6小鼠随机分成五组：第I组-对照组：用磷酸盐缓冲盐水(PBS)；第II组-模型组：STZ；第III组-低剂量组：STZ注射前2小时注射1.25mg/kg/day膜联蛋白V；第IV组-中剂量组：STZ注射前2小时注射2.5mg/kg/day膜联蛋白V；第V组-高剂量组：STZ注射前2小时注射5mg/kg/day膜联蛋白V。在模型的剂量选取中，我们在STZ注射前2小时注射膜联蛋白V，选取了7个剂量点，分别为：0.3125，0.625，1.25，2.5，5，10，20mg/kg/day，但在本实施例中主要提供效果最好的三个点进行研究，即1.25，2.5，5mg/kg/day。使用链脲佐菌素诱导小鼠糖尿病模型，具体步骤为：小鼠过夜禁食后，通过将溶于0.1M柠檬酸缓冲液(pH＝4.5)，剂本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种膜联蛋白V的应用，其特征在于，在制备延缓糖尿病进程药物中的应用。

【技术特征摘要】
1.一种膜联蛋白V的应用，其特征在于，在制备延缓糖尿病进程药物中的应用。2.根据权利要求1所述的一种膜联蛋白V的应用，其特征在于，在制备改善糖尿病生理指标和代谢状况的药物中的应用。3.根据权利要求2所述的膜联蛋白V在制备改善糖尿病生理指标和代谢状况的药物中的应用，其特征在于，所述的糖尿病生理指标和代谢状况为禁食血糖、体重、血清胰岛素水平、葡萄糖耐量、食物摄入量、摄水量和尿量中的一种或多种。4.根据权利要求1所述的一种膜联蛋白V的应用，其特征在于，在制备改善糖尿病模型胰岛素信号通路的药物中的应用。5.根据权利要求1所述的一种膜联蛋白V的应用，其特征在于，在制备改善糖尿病肝脏、胰腺...

【专利技术属性】
技术研发人员：华子春，林艳，
申请(专利权)人：江苏靶标生物医药研究所有限公司，常州南京大学高新技术研究院，
类型：发明
国别省市：江苏,32