一种血清中胆固醇的检测方法技术

本发明专利技术公开了一种血清中胆固醇的检测方法，包括如下步骤：(1)将β‑CD@AuNPs、CQDs和适量以无水乙醇为溶剂制备的胆固醇储备液混合后，配制不同浓度的胆固醇标准溶液，于特定荧光条件下绘制工作曲线；(2)获得待测血清，进行检测；(3)将步骤(2)的检测结果代入工作曲线中，得到待测血清中的胆固醇浓度。本发明专利技术不仅能够克服色谱法，电化学法，比色法，等离子体吸收光谱法等技术的缺陷，且具检测线性范围广、灵敏度较高、选择性好等优势。

【技术实现步骤摘要】
一种血清中胆固醇的检测方法
本专利技术属于生物小分子分析检测
，具体涉及一种血清中胆固醇的检测方法。
技术介绍
胆固醇最早是从胆石中发现的，其广泛存在于动物体内，是所有动物细胞膜的基本结构成分，在维持膜结构完整性和流动性方面发挥重要作用，而且合成胆汁酸，维生素D和激素都需要胆固醇做原料。健康人血清中总胆固醇的正常水平一般低于5.2mmol·L-1。血液中胆固醇水平过高，称为高胆固醇血症，会明显增加冠心病，高血压和动脉粥样硬化等血管疾病的风险。另一方面，胆固醇的缺乏被认为与抑郁症、癌症和脑出血等疾病的出现相关联。随着生活水平的提高，胆固醇异常导致的冠心病、糖尿病和高血压等疾病呈增长趋势，并且胆固醇被世界卫生组织国际癌症研究机构列为3类致癌物。因此，开发一种检测血清中胆固醇含量的方法具有极为重要的意义。目前开发了多种分析方法用于胆固醇含量的检测，如色谱和电化学结合法，色谱法，电化学法，比色法，等离子体吸收光谱法等。但是大多数方法需要繁琐的实验过程且实验成本高；或者依赖于胆固醇氧化酶的高选择性催化反应进行胆固醇测定，但是此方法中酶易失活导致方法的不稳定性和成本昂贵；或者方法中使用了具有危害性的化学试剂。因此，有必要开发一种选择性高，成本低，绿色环保的方法进一步改善目前方法的缺陷。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术缺陷，提供一种血清中胆固醇的检测方法。本专利技术的技术方案如下：一种血清中胆固醇的检测方法，包括如下步骤：(1)将β-CD@AuNPs、CQDs和适量以无水乙醇为溶剂制备的胆固醇储备液混合后，配制不同浓度的胆固醇标准溶液；将荧光激发波长固定在390nm，分别记录不同浓度的胆固醇标准溶液的荧光发射光谱，以荧光发射峰Em＝528nm的强度作为定量依据，以荧光恢复效率(F-F0)/F0对不同胆固醇浓度做线性拟合，测定检测限，F0为不加胆固醇的荧光发射峰Em＝528nm的强度，F对应不同胆固醇标准溶液的浓度的荧光发射峰Em＝528nm的强度；当胆固醇浓度为10-210μmol·L-1，荧光恢复效率(F-F0)/F0与胆固醇浓度呈现良好的线性关系，获得线性工作曲线y＝0.0052x-0.0139，R2＝0.996，y＝(F-F0)/F0，x为胆固醇浓度；上述β-CD@AuNPs是以氯金酸(HAuCl4)溶液为前驱体，以β-环糊精(β-CD)为还原剂和稳定剂，加热回流一步制备而成，上述CQDs是以氯化十六烷基吡啶(CPC)溶液为前驱体，通过超声一步法合成；(2)将新鲜血液于室温下保存过夜，隔天取其中淡黄色的上清液离心，获得血清；在上述血清中加入0～160μmol·L-1的胆固醇标准溶液，根据步骤(1)的参数进行荧光测定，重复测定至少三次，获得相应的荧光发射峰Em＝528nm的强度；(3)将步骤(3)获得的荧光发射峰Em＝528nm的强度代入上述线性工作曲线中，获得血清中的胆固醇浓度。在本专利技术的一个优选实施方案中，所述β-CD@AuNPs的制备方法为：反应容器中先后加入超纯水，0.1mol·L-1且pH7.0的PBS缓冲液，0.01mol·L-1的HAuCl4溶液和0.01mol.L-1的β-CD水溶液，搅拌均匀后，移入油浴锅中，在100℃下强力搅拌回流60min，溶液颜色由浅黄色变成浅红色最终变为葡萄酒红，待溶液自然冷却后，经0.45μm滤膜过滤后于4℃下保存。进一步优选的，所述超纯水、PBS缓冲液、HAuCl4溶液和β-CD水溶液的体积比为35∶5∶1∶10。在本专利技术的一个优选实施方案中，所述CQDs的制备方法为：往15mmol·L-1的CPC溶液中加入2.0mol·L-1的NaOH溶液，在超声30min后，用浓盐酸调节溶液pH值至7.0，使反应终止，再经透析袋透析24h后，冷冻干燥得到CQDs固体，根据实验需要的浓度将CQDs固体重新溶解于水，4℃保存；超声期间溶液颜色由无色变成浅黄最终变成棕黄色。进一步优选的，所述CPC溶液和NaOH溶液的体积比为100∶9。在本专利技术的一个优选实施方案中，所述β-CD@AuNPs的平均粒径分别为24-26nm。在本专利技术的一个优选实施方案中，所述CQDs的平均粒径分别为2.8-3.2nm。本专利技术的有益效果是：本专利技术不仅能够克服色谱法，电化学法，比色法，等离子体吸收光谱法等技术的缺陷，且具检测线性范围广、灵敏度较高、选择性好等优势。附图说明图1为本专利技术实施例1中(a)β-CD@AuNPs的透射电子的显微镜(TEM)图；(b)单个β-CD@AuNPs的高分辨透射电子的显微镜(HRTEM)图；(c)β-CD@AuNPs的粒径分布直方图；(d)CQDs的TEM图和(d)粒径分布直方图。图2为本专利技术实施例1中(a)CQDs的荧光激发光谱(Ex＝390nm)和发射光谱(Em＝528nm)，β-CD@AuNPs的紫外-可见吸收光谱(Abs)，插图中1-4和5-8分别为日光下和365nm紫外光照射下的CQDs、β-CD@AuNPs、CQDs/β-CD@AuNPs、CQDs/β-CD@AuNPs/胆固醇；(b)CQDs、CQDs/β-CD@AuNPs和CQDs/β-CD@AuNPs中加入60μmol·L-1胆固醇的荧光光谱。图3为本专利技术实施例1中(a)CQDs中加入不同浓度的β-CD@AuNPs后的荧光发射光谱；(b)F0/F与β-CD@AuNPs浓度的关系曲线(F0为不加β-CD@AuNPs时CQDs的荧光发射峰强度，F为加入不同浓度的β-CD@AuNPs后荧光发射峰强度，Ex＝390nm，Em＝528nm)；(c)CQDs中加入β-CD@AuNPs(2mL)前后荧光强度随时间变化曲线；(d)CQDs/β-CD@AuNPs中加入胆固醇(60μmol·L-1)后荧光强度随时间变化曲线。图4为本专利技术实施例1中(a)不同物质对CQDs/β-CD@AuNPs的荧光选择性响应；(b)CQDs/β-CD@AuNPs对胆固醇浓度的荧光标准曲线拟合及相应的比色图像。具体实施方式以下通过具体实施方式对本专利技术的技术方案进行进一步的说明和描述。实施例1：1、β-CD@AuNPs和CQDs的制备β-CD@AuNPs的制备是以氯金酸(HAuCl4)溶液为前驱体，以β-环糊精(β-CD)为还原剂和稳定剂，加热回流一步制备β-环糊精修饰的金纳米粒子(β-CD@AuNPs)。具体步骤如下：烧瓶中先后加入35mL超纯水，5mLPBS缓冲液(0.1mol·L-1，pH7.0)，1mL的HAuCl4溶液(0.01mol·L-1)和10mL的β-CD水溶液(0.01mol·L-1)，搅拌均匀后，移入油浴锅中，在100℃下强力搅拌回流60min，溶液颜色由浅黄色变成浅红色最终变为葡萄酒红。待溶液自然冷却后，经0.45μm滤膜过滤后于4℃下保存(pH7.0的PBS缓冲溶液(0.1mol·L-1)配制：将0.68g的KH2PO4加入29.1mL的0.1mol·L-1的NaOH溶液中，再用超纯水稀释至100mL)。所制得的β-CD@AuNPs如图1(a)-(c)所示。CQDs的制备是以氯化十六烷基吡啶(CPC)溶液为前驱体，通过超声一步法合成。主要步骤如下：往100mL(15mmol·L-1)的CPC溶液中加入9mL(本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种血清中胆固醇的检测方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)将β‑CD@AuNPs、CQDs和适量以无水乙醇为溶剂制备的胆固醇储备液混合后，配制不同浓度的胆固醇标准溶液；将荧光激发波长固定在390nm，分别记录不同浓度的胆固醇标准溶液的荧光发射光谱，以荧光发射峰Em＝528nm的强度作为定量依据，以荧光恢复效率(F‑F0)/F0对不同胆固醇浓度做线性拟合，测定检测限，F0为不加胆固醇的荧光发射峰Em＝528nm的强度，F对应不同胆固醇标准溶液的浓度的荧光发射峰Em＝528nm的强度；当胆固醇浓度为10‑210μmol·L‑1，荧光恢复效率(F‑F0)/F0与胆固醇浓度呈现良好的线性关系，获得线性工作曲线y＝0.0052x‑0.0139，R2＝0.996，y＝(F‑F0)/F0，x为胆固醇浓度；上述β‑CD@AuNPs是以氯金酸(HAuCl4)溶液为前驱体，以β‑环糊精(β‑CD)为还原剂和稳定剂，加热回流一步制备而成，上述CQDs是以氯化十六烷基吡啶(CPC)溶液为前驱体，通过超声一步法合成；(2)将新鲜血液于室温下保存过夜，隔天取其中淡黄色的上清液离心，获得血清；在上述血清中加入0～160μmol·L‑1的胆固醇标准溶液，根据步骤(1)的参数进行荧光测定，重复测定至少三次，获得相应的荧光发射峰Em＝528nm的强度；(3)将步骤(3)获得的荧光发射峰Em＝528nm的强度代入上述线性工作曲线中，获得血清中的胆固醇浓度。...

【技术特征摘要】
1.一种血清中胆固醇的检测方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)将β-CD@AuNPs、CQDs和适量以无水乙醇为溶剂制备的胆固醇储备液混合后，配制不同浓度的胆固醇标准溶液；将荧光激发波长固定在390nm，分别记录不同浓度的胆固醇标准溶液的荧光发射光谱，以荧光发射峰Em＝528nm的强度作为定量依据，以荧光恢复效率(F-F0)/F0对不同胆固醇浓度做线性拟合，测定检测限，F0为不加胆固醇的荧光发射峰Em＝528nm的强度，F对应不同胆固醇标准溶液的浓度的荧光发射峰Em＝528nm的强度；当胆固醇浓度为10-210μmol·L-1，荧光恢复效率(F-F0)/F0与胆固醇浓度呈现良好的线性关系，获得线性工作曲线y＝0.0052x-0.0139，R2＝0.996，y＝(F-F0)/F0，x为胆固醇浓度；上述β-CD@AuNPs是以氯金酸(HAuCl4)溶液为前驱体，以β-环糊精(β-CD)为还原剂和稳定剂，加热回流一步制备而成，上述CQDs是以氯化十六烷基吡啶(CPC)溶液为前驱体，通过超声一步法合成；(2)将新鲜血液于室温下保存过夜，隔天取其中淡黄色的上清液离心，获得血清；在上述血清中加入0～160μmol·L-1的胆固醇标准溶液，根据步骤(1)的参数进行荧光测定，重复测定至少三次，获得相应的荧光发射峰Em＝528nm的强度；(3)将步骤(3)获得的荧光发射峰Em＝528nm的强度代入上述线性工作曲线中，获得血清中的...

【专利技术属性】
技术研发人员：李顺兴，郑凤英，李跃海，
申请(专利权)人：闽南师范大学，
类型：发明
国别省市：福建,35