基于氧化石墨烯的荧光增强型适配体传感器及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了基于氧化石墨烯的荧光增强型的适配体传感器，用于快速高灵敏度检测嗜水气单胞菌和迟缓爱德华氏菌，以及对其在鱼体内(如鲫鱼)进行成像。我们的方法可以为鱼类病原菌的快速鉴定和成像提供一种新方法，这为将来开发用于病原菌的示踪，诊断和治疗的新型纳米生物传感系统提供了机会。

【技术实现步骤摘要】
基于氧化石墨烯的荧光增强型适配体传感器及其制备方法和应用
本专利技术涉及生物检测技术，具体涉及基于氧化石墨烯的荧光增强型适配体传感器及其制备方法和应用。
技术介绍
随着世界渔业的快速发展及水产养殖环境的日益恶化，致病菌引起的各种鱼类疾病已成为影响水产养殖业的重要威胁因素。嗜水气单胞菌(A.hydrophila)和迟缓爱德华氏菌(E.tarda)作为水产养殖中的常见病原菌，不仅给水产养殖业带来巨大经济损失，而且还会对鱼类和人类造成疾病。因此，专利技术一种快速，灵敏，高特异性，低成本的检测鱼类病原菌(如A.hydrophila和E.tarda)的方法具有重要意义。传统的鱼类病原菌的检测方法，如生化培养，PCR和免疫诊断技术，都受到过程或样品制备过程复杂，分析时间长，成本高和低特异性等缺点的限制。近年来，将生物分子识别元件(如酶、抗体、噬菌体、适配体等)结合荧光、电化学、比色等信号转换系统构建生物传感器用于检测病原菌的分析方法引起了许多研究者的兴趣。在上述可能的识别检测的策略中，基于抗体识别的方法简单且具有高度选择性，但是依赖于动物中产生的抗体，其成本较昂贵并且重复性差。因此，迫切需要开发一种基于新型分子探针的简单方法，用于快速，高灵敏地检测鱼类病原菌。适配体，被称为“人工抗体”，与天然抗体相比具有明显的优势，如结构简单，成本低，不易变性和失活。因此，许多研究人员使用适配体作为新的识别元件结合不同的分析方法来检测细胞、细菌和肿瘤标志物等分子。王周平等人将适配体作为识别分子与信号转换系统相结合，如表面增强拉曼散射(SERS)和上转换荧光分析，构建了适用于检测鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)的适配体传感器平台。郑磊等人开发了一种基于催化发夹组装(CHA)和双功能适配体检测癌细胞的荧光方法。这些基于适配体识别和检测的方法在生物分析和早期诊断方面具有巨大潜力。尽管已经有一些检测鱼类病原菌(如副溶血性弧菌和哈维氏弧菌)的文章。然而，却没有关于使用适配体结合纳米材料检测A.hydrophila和E.tarda的报道。氧化石墨烯(GO)是一种新型的碳二维纳米材料，易于合成，具有优异的光学和胶体稳定性以及高消光系数等特性。GO具有较高的比表面积和丰富的表面官能团，使其具有良好的亲水性和相容性，光响应性能，小尺寸效应等特性。此外，氧化石墨烯及其衍生物已广泛应用于生物传感、生物成像、药物靶向运输、组织工程等领域。
技术实现思路
为了解决现有技术的不足本专利技术提供了一种基于氧化石墨烯的荧光增强型适配体传感器用于快速检测嗜水气单胞菌(A.hydrophila)和迟缓爱德华氏菌(E.tarda)。本专利技术的技术方案是：基于氧化石墨烯的荧光增强型适配体传感器的制备方法，以GO作为猝灭剂，猝灭用羧基荧光素FAM标记的适配体Aptamer1和Aptamer2的荧光后制得。本专利技术的进一步改进包括：将0.02mg/mL氧化石墨烯与200nM适配体Apt1和Apt2，在结合缓冲液即50mMTris-HCl，100mMNaCl，5mMKCl，1mMMgCl2，pH7.4中混合反应8min即得。本专利技术的另一目的在于提供了基于氧化石墨烯的荧光增强型适配体传感器的制得方法。本专利技术还提供了具有FAM标记的两种适配体Aptamer1和Aptamer2作为荧光探针在制备基于氧化石墨烯的荧光增强型适配体传感器中的应用。所述具有FAM标记的适配体Aptamer1和Aptamer2作为荧光探针在检测A.hydrophila和E.tarda中的应用。所述的应用，以GO作为猝灭剂，猝灭用羧基荧光素FAM标记的适配体Aptamer1和Aptamer2的荧光，通过监测荧光信号变化来分别检测A.hydrophila和E.tarda。由于GO上吸附适配体的荧光标记染料与GO之间的有效荧光共振能量转移，GO可以猝灭用羧基荧光素(FAM)标记的适配体Aptamer1(Apt1)和Aptamer2(Apt2)的荧光。加入A.hydrophila和E.tarda后，原本吸附在GO表面上的特异性识别病原菌的适配体从GO表面释放，荧光得到明显恢复。基于该原理，可构建基于氧化石墨烯的荧光增强型适配体传感器，并用于快速检测鱼类病原菌。我们的方法为鱼类病原菌的快速识别与检测提供新手段、新方法，为未来实现现场的快速检测提供理论依据。本专利技术基于氧化石墨烯和适配体识别的的荧光增强型适配体传感器，用于A.hydrophila和E.tarda的快速检测和成像。FAM标记的适配体荧光可以被GO猝灭，因为GO吸附适配体上的荧光标记物FAM与GO之间有效的荧光共振能量转移(FRET)。加入A.hydrophila和E.tarda后，最初吸附在GO表面上的适配体特异性识别病原菌(A.hydrophila和E.tarda)，然后从GO表面释放，导致荧光恢复。此外，我们的方法可用于鲫鱼体内A.hydrophila和E.tarda的检测和成像。并且我们的方法可以为鱼类病原菌的快速鉴定和成像提供一种新方法，这为将来开发用于病原菌的追踪，诊断和治疗的新型纳米生物传感系统提供了机会。附图说明图1A是FAM标记的适配体Apt1在不同条件下的荧光发射光谱。图1B是FAM标记的适配体Apt2在不同条件下的荧光发射光谱。图1C是Apt1与GO的最佳配比。图1D是Apt2与GO的最佳配比。图2A是GO的SEM图像图2B是GO的AFM图像和高度分析。图2C是适配体Apt1-GO复合物的AFM图像和高度分析。图2D是适配体Apt2-GO复合物的AFM图像和高度分析。图3A是GO(a)，Apt1(b)，Apt2(c)，Apt1-GO复合物(d)，Apt2-GO复合物(e)的UV-vis吸收光谱。图3B是GO，Apt1-GO复合物，Apt1-GO和A.hydrophila混合物，Apt2-GO复合物，Apt2-GO和E.tarda混合物的Zeta电位图。图3C是和GO，Apt1-GO复合物，Apt1-GO和A.hydrophila混合物，Apt2-GO复合物，Apt2-GO和E.tarda混合物的水合粒径分布分析。图4A是Apt1-GO复合物(200nM：0.02mg/mL)在不同浓度的A.hydrophila存在下的荧光发射光谱(0,0.1,12.5,1.3×103,6.3×104,1.3×105CFU/mL)。图4B是从图A的光谱获得的校准曲线，其显示荧光强度的变化与嗜水气单胞菌浓度在基数10的对数呈线性依赖性(log10C，CFU/mL)。图4C是在不同浓度(0,0.1,1.3,12.5,1.3×102,1.3×103,2.5×103,6.3×103,1.3×104CFU/mL)的E.tarda存在下Apt2-GO复合物的荧光发射光谱。图4D是从图4C的光谱获得的校准曲线，显示荧光强度变化对迟缓爱德华氏菌浓度的线性依赖性。图4E是Apt1和Apt2在存在和不存在GO时对对应鱼类病原菌的荧光响应对比。图5A是Apt1-GO复合物(A)对不同细菌的荧光响应。图5B是Apt2-GO复合物(B)对不本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.基于氧化石墨烯的荧光增强型适配体传感器的制备方法，其特征在于，以GO作为猝灭剂，猝灭用羧基荧光素FAM标记的适配体Aptamer 1或Aptamer 2的荧光后制得。

【技术特征摘要】
1.基于氧化石墨烯的荧光增强型适配体传感器的制备方法，其特征在于，以GO作为猝灭剂，猝灭用羧基荧光素FAM标记的适配体Aptamer1或Aptamer2的荧光后制得。2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，将0.02mg/mL氧化石墨烯与200nM适配体Aptamer1：5’-FAM-GGTGGAGGTGGGGGTTGGGTGGGGTTGCGTTCAGT-3’；或200nMAptamer2：5’-FAM-GCTTTTTCAAGTTGTGCTCCGTGTTTAGTTTTGTG-3’，在结合缓冲液即50mMTris-HCl，100mMNaCl，5mMKCl，1mMMgCl2，pH7.4中混合反应8min即得。3.基于氧化石墨烯的荧光增强型适配体传感器，其特征在于，按照权利要求1或2所述方法制得。4.具有FAM标记的适配体作为荧光探针在制备基于氧化石墨烯的...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄伟涛，朱秋燕，张福瑞，路娇扬，张新星，夏立秋，丁学知，
申请(专利权)人：湖南师范大学，
类型：发明
国别省市：湖南,43