一种水稻α-淀粉酶及其编码基因与应用制造技术

本发明专利技术提供一种水稻α‑淀粉酶及其编码基因在花粉育性调控中的用途，属于生物技术领域。本发明专利技术通过克隆水稻日本晴α‑淀粉酶的核苷酸序列，构建重组表达载体和进行遗传转化。在PG47启动子驱动下，α‑淀粉酶在花粉发育后期特异性表达；同时在BT1转运信号肽的引导下，该α‑淀粉酶可降解花粉粒中的淀粉，造成水稻转基因花粉不育，准确性高，有效避免了转基因作物通过花粉将转基因元件传播给其它作物品种。本发明专利技术的α‑淀粉酶可用于保持雄性不育植株的纯合隐性状态，从而在杂交制种过程中省去人工去雄步骤，并可大量扩繁不育系，减少了劳动力的投入以及对产量的影响，使其在作物种植资源改良和遗传育种等方面具有广阔的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种水稻α-淀粉酶及其编码基因与应用
本专利技术属于生物
，具体涉及一种水稻α-淀粉酶及其编码基因在花粉育性控制中的应用，还涉及结合该α-淀粉酶对淀粉的水解功能以影响水稻的雄性生育力的应用。通过利用现代生物技术，将其应用于杂交种子生产技术体系，既能保证制种质量，又可提高制种效率；还能有效防止转基因扩散。
技术介绍
杂交水稻育种是有效提高水稻产量和品质的主要途径。由于杂交技术的应用，使得增产、抗病、抗虫、抗旱、抗除草剂、耐涝、抗寒、耐盐和抗倒伏等各种性状的聚合都成为了可能。杂交技术的应用依赖于向母本提供花粉的父本，然后通过父本和母本的杂交方法获得杂交种。尽管水稻杂交优势利用是最为经济有效的提高水稻产量和品质的途径之一，但其仍然存在较多的限制因素，例如各种优势性状的聚合难度较大、杂交作物所占的比重较小等。虽然大部分的农作物都尽可能的利用杂种优势，但仍然存在巨大的潜力。目前应用于水稻生产上的主要杂交育种技术有“三系法”和“两系法”。“三系法”由于受恢保关系的制约，限制了水稻种质资源的利用及强优势组合的选育；而“两系法”由于其不育系育性受环境条件因素的影响调控，在实际制种生产中隐藏着较大的风险。由此可见，传统的“三系法”和“两系法”均存在一定的技术缺陷，一定程度上限制了杂交水稻的进一步发展和推广应用，而雄性不育系资源是严重制约水稻杂交技术发展的关键因素。此外，“三系法”和“两系法”育种方法周期长、见效慢，难以满足生产发展的迫切需求。为了解决“三系法”和“两系法”等繁殖雄性不育材料的问题，先后有众多科学家想通过利用分子设计方法来解决这一问题。1993年，PLANTGENETICSYSTEM公司提出专利申请(WilliamsM,LeemansJ..Maintenanceofmale-sterileplants.1993.PatentNo.WO93/25695.)，即在雄性不育植株中转入连锁的育性恢复基因、花粉失活(败育)基因和用于筛选的标记基因，即可获得该不育系植株的保持系，然后通过自交实现不育系和保持系的繁殖。此外，2002年Perez-Prat等人提出通过在雄性不育的植株中转入连锁的育性恢复基因和筛选标记基因两套元件就可获得雄性不育植株的保持系，并进一步可繁育成不育系(Perez-Prat,E.,andvanLookerenCampagne,M.M..Hybridseedproductionandthechallengeofpropagatingmale-sterileplants.TrendsPlantSci.2002.7,199-203.)。这些构想的提出为精确利用分子生物学技术开展作物分子杂交育种提供了新的思路。当前有很多研究表明其它功能基因也可能通过生物技术方法构建转基因雄性不育植株，然而，近年来随着转基因作物的种类和种植面积的不断增加，转基因安全问题也受到越来越多人的关注和重视。转基因植物中携带的外源基因可通过天然杂交的方式整合到非转基因品种或其它野生近缘种中，从而造成转基因安全问题。在杂交亲和的植物种类之间，花粉介导的基因漂移是不可避免的。植物的雄性不育主要表现在花粉败育，它涉及雄性器官缺失、造孢细胞异常、减数分裂异常、胼胝质代谢异常、绒毡层发育异常、花粉壁发育异常、花药开裂异常和花粉萌发失败等各个过程。因此，了解花粉发育的全过程和分子机理是研究植物雄性不育的基础和关键所在。花粉的发育过程较为复杂，它涉及到许多基因的表达调控，其中在花粉发育后期，淀粉能为花粉的萌发和花粉管的延伸储备能量。因此，当花粉粒中的淀粉提前被α-淀粉酶降解，使得花粉粒能量来源被瓦解，最终遏制花粉的生长，出现畸形花粉粒，导致植物雄性不育。淀粉酶可以水解淀粉，主要分布在动植物、细菌和真菌中，人们通过利用生物技术，已经克隆出了各种淀粉酶基因(崔锦,马向东(2009)淀粉酶基因的多样性.郑州牧业工程高等专科学校学报,29(2):21-23)，同时对淀粉酶的多样性进行了相关研究。研究表明，淀粉酶基因除了在来源多样性外，其基因结构和功能方面皆呈现多样性。淀粉酶可分为α-淀粉酶、β-淀粉酶和λ-淀粉酶，其中α-淀粉酶属于内切葡萄糖苷酶，可以从淀粉链内部随机切割α-1，4糖苷键，使淀粉水解成麦芽糖和葡萄糖等，并释放能量(MorrisGP,BeckPL,HerridgeMS,etal.Hapten-inducedmodelofchronicinflammationandulcerationintheratcolon[J].Gastroenterology,1989,96(3):795-803)。因此，在成熟花粉中，适量的淀粉酶可水解淀粉，其所产生的能量可提供给花粉的正常发育以及花粉管的萌发和生长。然而，若在花粉形成过程中淀粉酶过表达或沉默表达，都会降低花粉能量代谢水平，导致淀粉积累量不足，从而产生败育花粉。已有研究报道，玉米α-淀粉酶基因与花粉发育后期特异性表达启动子重组，可使转基因玉米植株表达α-淀粉酶，导致转基因花粉败育，从而有效降低花粉介导的基因漂移的风险(Zhang,D.,Wu,S.,An,X.,Xie,K.,Dong,Z.,Zhou,Y.,Xu,L.,Fang,W.,Liu,S.,Zhu,T.,Li,J.,Rao,L.,Zhao,J.,andWan,X.(2017).Constructionofamulti-controlsterilitysystemforamaizemale-sterilelineandhybridseedproductionbasedontheZmMs7geneencodingaPHD-fingertranscriptionfactor.PlantBiotechnol.J.16,459-471.)。这些α-淀粉酶基因为水稻通过生物技术实现不育系转基因植株的获得，特别是在控制育性和转基因漂移等方面提供了新的选择。为利用上述技术，需要不同来源的α-淀粉酶基因，例如重要农作物水稻，但相关研究还鲜少报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种水稻α-淀粉酶基因在导致花粉败育及制备转基因花粉败育植株中的应用，即来自水稻的一个新的α-淀粉酶基因，从而可有效避免转基因花粉的污染，以获得新的雄性不育系及其应用。为实现上述目的，本专利技术提供了一种水稻α-淀粉酶基因，包括：1)SEQIDNO：1所示的核苷酸序列，或2)在SEQIDNO：1所示的核苷酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个核苷酸且具有同等功能的由a)衍生的核苷酸序列；或3)在严格条件下与SEQIDNO：1所示序列杂交且可表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；或4)与1)、2)或3)的核苷酸序列具有90％以上同源性且可表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。本专利技术还提供与水稻α-淀粉酶核苷酸序列互补的DNA分子。本领域技术人能够容易鉴定并利用与水稻花粉败育基因α-淀粉酶核苷酸序列互补的DNA分子，因此，在严格条件下与本专利技术的花粉败育基因α-淀粉酶序列或其片段杂交的序列包括在本专利技术中。其中，所述核苷酸序列互补，是指在严格条件下能与α-淀粉酶的DNA序列杂交。所述的严格条件是指探针与其靶序列杂交至可探测程度超过与其它序列杂交的条件。严格条件具有序列依赖性，且会因环境的不同而有所改本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种水稻α‑淀粉酶在花粉育性控制中的应用，所述的水稻α‑淀粉酶具有：1）由SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列组成的蛋白；或2）将SEQ ID NO：4的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加由SEQ ID NO：4衍生的且保持SEQ ID NO：4所示的蛋白功能的蛋白。

【技术特征摘要】
1.一种水稻α-淀粉酶在花粉育性控制中的应用，所述的水稻α-淀粉酶具有：1）由SEQIDNO：4所示的氨基酸序列组成的蛋白；或2）将SEQIDNO：4的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加由SEQIDNO：4衍生的且保持SEQIDNO：4所示的蛋白功能的蛋白。2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述水稻α淀粉酶的核苷酸序列为：1）SEQIDNO：1所示的核苷酸序列，或2）在SEQIDNO：1所示的核苷酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个核苷酸且具有同等功能的由1）衍生的核苷酸序列；或3）在严格条件下与SEQIDNO：1所示序列杂交且可表达相同功能蛋白质的核苷酸序列，或4）与1）、2）或3）的核苷酸序列具有90％以上同源性且可表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。3.一种水稻α-淀粉酶在制备花粉败育转基因植株中的应用，所述的水稻α-淀粉酶的氨基酸序列为：1）由SEQIDNO：4所示的氨基酸序列组成的蛋白；或2）将SEQIDNO：4的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加由SEQIDNO：4衍生的且保持SEQIDNO：4所示的蛋白功能的蛋白。4.水稻α-淀粉酶的编码基因具有：1）SEQIDNO：1所示的核苷酸序列，或2）在SEQIDNO：1所示的核苷酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个核苷酸且具有同等功能的由1）衍生的核苷酸序列；或3）在严格条件下与SEQIDNO：1所示序列杂交且可表达相同功能蛋白质的核苷酸序列，或4）与1）、2）或3）的核苷酸序列具有90％以上同源性且可表达相同...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐晓艳，王梦龙，彭小群，严维，尹峰，陈竹锋，
申请(专利权)人：深圳市作物分子设计育种研究院，深圳广三系农业科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44