调控植物种子大小的基因及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种调控植物种子大小的基因及其应用，属于植物分子生物学、生物化学、遗传学和植物育种领域。本发明专利技术通过EMS诱变水稻获得一个大粒突变体，并利用SIMM方法定位突变性状相关基因，获得一个调控植物种子大小的基因DLZ，该基因位于12号染色体上，基因座位号为LOC_Os12g41820（MSU登陆号）。基因DLZ的突变可导致水稻产生大粒性状表型，通过调节该基因的表达可调控植物的籽粒大小，用以获得大粒突变体植株以及改良作物的方法，对于作物的高产育种工作具有重要的理论和实践意义。

Genes regulating seed size and their application

【技术实现步骤摘要】
调控植物种子大小的基因及其应用
本专利技术涉及植物分子生物学、生物化学、遗传学和植物育种领域，特别涉及一个调控种子大小的基因，更具体地涉及一个调控种子大小的DLZ基因的核酸分子及其突变体及其在育种中的应用。技术背景植物种子是人类赖以生存的最重要食物来源，稻米、玉米和小麦是我国的三大主粮，粮食产量和价格影响着国计民生。人口持续增长与耕地面积不断减少的现状，对我国粮食生产提出了严峻的挑战。以水稻为例，水稻产量主要决定于三个要素——有效穗数、每穗实粒数和粒重，单位面积产量还受到水稻株型的影响，这些因素都是受多基因与环境互作控制的复杂性状，并且各个子性状之间还存在相关性，要改良产量性状还需协调好各构成要素之间的关系。根据现有的经验，高产品种可以分成四个类型，即大穗偏重型、大粒偏重型、多穗偏重型和综合兼顾型。单株有效穗数的遗传力最小，很容易受环境影响，对单株有效穗数的改良不如通过合理密植来调整单位面积的有效穗数。每穗粒数的遗传力适中，改良起来仍有不小的难度。相比之下，粒重是产量构成要素中遗传力最高的，对其进行改良相对容易(张启发，绿色超级稻的构想与实践，科学出版社，2009)。水稻粒重由种子大小即颖壳的体积和胚乳发育状况两个因素决定。颖壳通常在水稻开花之前就已经定型，受精之后灌浆形成的米粒大小和形状受制于颖壳的容积，因此，颖壳的体积是粒重大小的先决条件。对颖壳形状与大小的描述一般称为粒形，通常用粒长、粒宽、粒厚和长宽比表示。值得一提的是，粒形不仅是重要的产量性状之一，也是主要的外观品质性状，粒形与稻米的其它品质性状如垩白率、糙米率、精米率之间也存在一定的相关性。因此，在育种中通过对种子大小与形状的选择，不仅可以提高产量潜力，还可以间接调控稻米品质。植物种子大小是多基因控制的数量性状，在前期大量的QTL扫描和定位的研究基础上，近十年来相关基因的克隆呈现一种爆发的趋势。对水稻等重要作物种子大小调控基因的挖掘和功能研究已经成为功能基因组学研究的一大热点。这些基因的发现和功能分析促进了植物种子大小基因调控网络研究的逐步深入，研究人员开始探索关键基因聚合的最佳设计，通过评价优异基因型聚合的增产效应，为创制设计型产量突破性的新品种提供理论指导和材料支撑。SIMM(SimultaneousIdentificationofMultipleMutations)(Yanetal.,Simultaneousidentificationofmultiplecausalmutationsinrice.FrontiersinPlantScience,2016)是一种基于二代测序技术的快速高效的定位突变基因的方法。与其他方法相比，SIMM可在不需要野生型基因组数据的前体下，以其他同样或相近来源的突变体为背景，同时鉴定多个突变性状相关的突变位点，具有更高的灵敏度和特异性，有助于快速定位候选功能基因，辅助水稻功能基因研究及水稻设计育种。此外，SIMM还可用于极端表型池QTL(数量性状基因座，QuantitativeTraitLocus)定位，有效缩小候选区间，辅助定位主效QTL基因。此方法也可有效应用于定位其他物种EMS突变体候选功能基因。高分辨率熔解曲线分析(High-ResolutionMeltingCurveAnalysis,HRM)是一种基于单核苷酸熔解温度不同而形成不同形态熔解曲线的基因分析新技术，具有极高的敏感性，可以检测出单个碱基的差异，并且成本低、通量高、速度快、结果准确、不受检测位点的局限。该方法无需使用序列特异性探针，而是利用一种饱和染料对PCR反应产物进行分析。其原理是：双链DNA的热稳定性受其长度和碱基组成的影响，序列变化会导致升温过程中双链DNA解链行为的改变。因为所用的荧光染料只能嵌入并结合到双链DNA上，因此利用实时PCR技术，通过实时检测双链DNA熔解过程中荧光信号值的变化，就能以生成不同形状熔解曲线的方式将PCR产物中存在的差异直观地展示出来。同时，借助于专业性的分析软件就可以对测试群体实现基于不同形状熔解曲线的基因分型或归类。本专利技术通过EMS诱变水稻籼稻品种“黄华占”，筛选得到一个由单个隐性核基因控制的大粒突变体，进而对该突变体进行表型鉴定、遗传分析和遗传背景鉴定，并利用SIMM方法、HRM技术和基因信息分析，成功定位并克隆了一个种子大小调控基因DLZ，该基因位于12号染色体上，基因座位号为LOC_Os12g41820(MSU登陆号)，该基因的突变可导致水稻产生大粒性状表型，从而可应用于控制作物籽粒的大小。本专利技术有助于提高作物产量和改善品质，为培育具有大粒重的水稻新品种提供基因资源和技术支持，对作物农艺性状的提高和高产分子育种工作具有重要的意义和应用价值。
技术实现思路
本文提到的所有参考文献都通过引用并入本文。除非有相反指明，本文所用的所有技术和科学术语都具有与本专利技术所属领域普通技术人员通常所理解的相同的含义。除非有相反指明，本文所使用的或提到的技术是本领域普通技术人员公知的标准技术。材料、方法和例子仅作阐述用，而非加以限制。本专利技术提供了一个调控种子大小的基因DLZ(大粒占，DaLiZhan)，该基因位于12号染色体上，其在水稻中的基因位点编号是LOC_Os12g41820(MSU登陆号，参考RiceGenomeAnnotationProject，http://rice.plantbiology.msu.edu/)，该基因突变后可以使含有该突变的植株的种子粒型变大。由于不同品种间的同一基因往往存在单核苷酸多态性，即同一基因的核苷酸序列往往存在个别碱基的差异，但是水稻品种数量很多，专利技术人不可能进行一一列举，因此本专利技术仅提供了在籼稻和粳稻中具有代表性的两个品种的序列。具体地，所述水稻DLZ基因的核苷酸序列选自下列组的序列之一：(a)如调控植物种子大小的基因LOC_Os12g41820所示的核苷酸序列；(b)如SEQIDNO：1、2、20或21所示的核苷酸序列；(c)其编码氨基酸序列如SEQIDNO：3、55、56、57、58、59、60或61所示的核苷酸序列；(d)在严谨条件下能够与(a)-(c)中所述序列的DNA杂交的DNA序列；或(e)与(a)-(d)所述序列有至少80％(优选为至少85％)序列相似性，且具有调控植物种子大小功能的DNA序列；或(f)与(a)-(e)之任一所述序列互补的DNA序列。上述调控种子大小的DLZ基因可从各种植物中分离获得。本领域技术人员应该知晓，本专利技术所述的种子大小调控基因还包括与DLZ基因的核苷酸序列或蛋白序列高度同源，并且具有同样的种子大小调控功能的同源基因。所述同源基因包括在严谨条件下能够与本专利技术所公开的DLZ基因的核苷酸序列杂交的DNA序列。本文中使用的“严谨条件”是公知的，包括诸如在含400mMNaCl、40mMPIPES(pH6.4)和1mMEDTA的杂交液中杂交，所述杂交的温度优选是53℃-60℃，杂交时间优选为12-16小时，然后用含0.5×SSC和0.1％SDS的洗涤液洗涤，洗涤温度优选为62℃-68℃，洗涤时间为15-60分钟。同源基因还包括与本专利技术所公开的DLZ基因所示的序列有至少80％、85％、90％、95％、98％、或99％序列相似性，且具有调控本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种调控植物种子大小的方法，通过影响调控植物种子大小的基因的表达调控植物的种子大小，其特征在于所述调控植物种子大小的基因的核苷酸序列选自下列组的序列之一：（a）如调控植物种子大小的基因LOC_Os12g41820所示的核苷酸序列；（b）如SEQ ID NO：1、2、20或21所示的核苷酸序列；（c）其编码氨基酸序列如SEQ ID NO：3、55、56、57、58、59、60或61所示的核苷酸序列；（d）在严谨条件下能够与（a）‑（c）中所述序列的DNA杂交的DNA序列；或（e）与（a）‑（d）所述序列有至少80%（优选为至少85%）序列相似性，且具有调控植物种子大小功能的DNA序列；或（f）与（a）‑（e）之任一所述序列互补的DNA序列。

【技术特征摘要】
2019.01.21 CN 20191005152501.一种调控植物种子大小的方法，通过影响调控植物种子大小的基因的表达调控植物的种子大小，其特征在于所述调控植物种子大小的基因的核苷酸序列选自下列组的序列之一：（a）如调控植物种子大小的基因LOC_Os12g41820所示的核苷酸序列；（b）如SEQIDNO：1、2、20或21所示的核苷酸序列；（c）其编码氨基酸序列如SEQIDNO：3、55、56、57、58、59、60或61所示的核苷酸序列；（d）在严谨条件下能够与（a）-（c）中所述序列的DNA杂交的DNA序列；或（e）与（a）-（d）所述序列有至少80%（优选为至少85%）序列相似性，且具有调控植物种子大小功能的DNA序列；或（f）与（a）-（e）之任一所述序列互补的DNA序列。2.权利要求1所述的方法，其特征在于，通过突变调控植物种子大小的基因的核苷酸序列以使该基因表达的蛋白质失活，从而获得具有大粒性状表型的植物材料，其中所述调控植物种子大小的基因的核苷酸序列选自下列组的序列之一：（a）如调控植物种子大小的基因LOC_Os12g41820所示的核苷酸序列；（b）如SEQIDNO：1、2、20或21所示的核苷酸序列；（c）其编码氨基酸序列如SEQIDNO：3、55、56、57、58、59、60或61所示的核苷酸序列；（d）在严谨条件下能够与（a）-（c）中所述序列的DNA杂交的DNA序列；或（e）与（a）-（d）所述序列有至少80%（优选为至少85%）序列相似性，且具有调控植物种子大小功能的DNA序列；或（f）与（a）-（e）之任一所述序列互补的DNA序列。3.权利要求2所述的方法，其中所述的突变包括在调控植物种子大小的基因的核苷酸序列上进行取代、缺失或添加一个或多个核苷酸。4.权利要求3所述的方法，其中所述的突变通过物理诱变、化学诱变或RNAi、TALEN、CRISPR/Cas9等定点突变技术获得。5.权利要求1-4之任一所述的方法在调控植物种子大小中的应用。6.一种表达盒、表达载体和工程菌在调...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐晓艳，许纯珏，严维，
申请(专利权)人：深圳市作物分子设计育种研究院，未名兴旺系统作物设计前沿实验室北京有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44