一种黄连毛状根的高效诱导方法技术

本发明专利技术公开了一种黄连毛状根的高效诱导方法，具体包括如下步骤：S1、无菌组培苗的获得；S2、外植体的预培养；S3、发根农杆菌的活化；S4、毛状根的诱导与除菌；S5、毛状根的液体培养；S6、毛状根的PCR检测。本发明专利技术通过对影响黄连毛状根产生的多种因素进行了比较系统的研究，探索出一些提高毛状根诱导率的方法，首次建立了黄连毛状根的高效诱导体系，毛状根诱导率高达88.7%。通过本发明专利技术获得的毛状根易于进行大量繁殖培养，具有产生次生代谢产物的潜能，为今后黄连毛状根的开发利用奠定了基础。

【技术实现步骤摘要】
一种黄连毛状根的高效诱导方法
本专利技术涉及一种利用发根农杆菌诱导药用植物黄连产生毛状根的方法。属于生物

技术介绍
黄连（CoptischinensisFranch.）又名味连、川连、鸡爪连、鸡爪黄连、光莲，为毛茛科黄连属多年生草本植物，在我国分布于四川、贵州、湖南、湖北、陕西、浙江、广东等地区。黄连属中黄连、三角叶黄连、云南黄连的干燥根茎即为中国传统中药“黄连”，始载于《神农本草经》，距今已有两千多年的历史。中医认为黄连味苦，性寒，入心、肝、胃、大肠经等，具有清热燥湿，泻火解毒的功效。用于湿热痞满，呕吐，泻痢，黄疸，高热神昏，心火亢盛，心烦不寐，血热吐衄，目赤吞酸，牙痛，消渴，痈肿疔疮；外治湿疹，湿疮，耳道流脓。现代研究表明，黄连的主要活性成分为小檗碱、黄连碱和药根碱，具有抗菌、消炎、抗癌、降糖、降脂、降血压、抗氧化、保护心肌、平滑肌和胃粘膜等作用，因此黄连是一种具有广泛药效的中药。随着对黄连活性成分的深入的研究，其新的药效同时也在不断被发现。目前黄连可应用于感染性疾病、心脑血管性疾病、糖尿病、烧伤、胃及十二指肠溃疡、萎缩性胃炎等，将来还会有更大的开发利用价值。黄连喜冷凉、湿润、荫蔽，忌高温、干旱，不能经受强烈的阳光，喜弱光，因此野生黄连一般分布在1200~1800m的山谷密林之中，但是由于过度采挖，野生资源已濒临灭绝，大多由人工栽培。由于黄连种子体积小，对生长环境的要求严格，自身要经过9个月左右的形态后熟和生理后熟过程才能萌发，因此在自然播种条件下，往往会出现发芽率低，出苗率不整齐等现象，影响了黄连的产量及品质。而在黄连的栽培过程中，土壤环境恶化及连作障碍危害也日益突出。因此，寻求新的替代品或新技术以满足市场需求和解决物种保护问题迫在眉睫。发根农杆菌（Agrobacteriumrhizogenes）是根瘤菌科（Rhizobiaceae）农杆菌属（Agrobacterium）的一类具有侵染性的革兰氏阴性土壤杆菌，能够感染大多数双子叶植物和少数单子叶植物及裸子植物。发根农杆菌中含有一个Ri质粒，其上面存在2个与转化有关的功能区，即T-DNA区和Vir区。当发根农杆菌感染寄主植物时，植物伤口产生小分子酚类化合物，从而诱导活化Ri质粒上的Vir区基因群，调控T-DNA区基因群整合到寄主细胞基因组中，从而引起植物形态和代谢的改变，导致了毛状根的产生。而T-DNA区基因群包含rolA、rolB、rolC、rolD等与毛状根表型性状产生有关的基因，其中rolB基因是毛状根形成最关键的基因，因此在对产生的毛状根进行检测时，常常以rolB作为检测目的基因。毛状根具有许多优点，如遗传性稳定，在不含有植物激素的条件下也能够快速生长，同时可以积累大量的次生代谢产物等，因其合成能力强大，毛状根培养物被誉为“植物化学工厂”，是生产植物次生代谢产物可靠而有效的途径。目前已有200多种植物成功诱导出毛状根，主要集中在双子叶植物，其中诱导频率较高包括茄科、菊科、十字花科以及旋花科等植物。药用植物是中药材的主要来源，次生代谢产物是中药材发挥临床疗效的物质基础，但正常情况下药用植物次生代谢产物产量很低，不能满足市场的需求。鉴于毛状根的诸多优点，利用药用植物毛状根来次生代谢产物具有广阔的发展前景。目前国内外学者已对26科96种药用植物进行了毛状根的相关研究，建立了长期的毛状根培养系统，并从中获得了次生代谢产物，其中已有人参、紫草、长春花、甜菜、胡萝卜等植物的毛状根实现了规模化生产。但是目前暂未见利用发根农杆菌诱导黄连产生毛状根的相关报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种高效的、利用发根农杆菌诱导药用植物黄连产生毛状根的方法，以期建立黄连毛状根培养体系，为今后黄连毛状根的开发利用奠定基础。本专利技术采取的技术方案如下：一种黄连毛状根的高效诱导方法，其特征在于，具体包括如下步骤：S1、无菌组培苗的获得选取生长健壮的黄连植株，用流动的自来水冲洗30min，在净化工作台中切取植株上带芽茎段，用无菌水清洗2~3次，再用75%乙醇浸泡30~50s，无菌水洗去残留，最后用0.2%升汞浸泡8~10min，无菌水洗去残留；消毒后的茎段置于无菌滤纸上吸干表面的水分，然后接种到含有0.5mg/LNAA、0.1mg/L6-BA的MS固体培养基上，置于适宜条件下培养直到长成具有真叶的无菌组培苗；S2、外植体的预培养在无菌条件下，将黄连无菌组培苗的真叶剪下，切成大小约0.5cm2的小块作为外植体接种到预培养基上，置于23~25℃、黑暗条件下培养2~3d，培养期间每天于同一时间段对外植体依次进行TDP辐照和60Coγ射线辐照的双重处理；S3、发根农杆菌的活化将发根农杆菌ACCC10060的菌种划线接种到YEB固体培养基上，置于28℃、黑暗条件下活化3次，挑取固体培养基上的单菌落接种到YEB液体培养基中，置于28℃、200r/min、黑暗条件下振荡培养至对数生长期，4℃下3500r/min离心10min收集菌体，并用MS液体培养基重悬、稀释制成菌悬液；S4、毛状根的诱导与除菌外植体预培养结束后转移至发根农杆菌菌悬液中进行真空辅助侵染15~20min，将外植体取出用无菌滤纸吸干表面多余的菌液，接种到共培养基上共培养3~4d，然后取出用无菌水冲洗后转接到除菌培养基上，进行除菌培养，每7d转接一次，并逐渐降低除菌培养基中抗生素浓度，直到培养基上无菌落出现，再将长度为2~3cm、生长迅速的毛状根单根切下转接到新鲜的除菌培养基上，继续进行除菌培养，彻底去除发根农杆菌；S5、毛状根的液体培养将彻底除菌的毛状根接种到1/2MS液体培养基中，置于21~23℃、800~1000lx散射光照的条件下连续培养，每20d左右继代一次，获得大量生长的毛状根；S6、毛状根的PCR检测采用CTAB法提取黄连无菌组培苗总DNA作为阴性对照，同法提取上述毛状根总DNA作为检测模板，采用碱解法提取发根农杆菌质粒DNA作为阳性对照，检测目的基因为rolB，进行PCR扩增后产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。所述步骤S1中适宜条件是指温度21~23℃，光照强度1500~2000lx，光照时间12~14h/d。所述步骤S2中预培养基的成分为：MS基本培养基+0.2mg/LZT+150μmol/L茉莉酸甲酯+100μmol/L乙酰丁香酮+3.5g/L植物凝胶。所述步骤S2中TDP辐照处理的参数为：辐照距离45cm，辐照时间35min，温度控制在30℃；60Coγ射线辐照处理的参数为：辐照剂量50Gy，剂量率1.84Gy/min。所述步骤S3中菌悬液的浓度为：菌悬液OD600值为0.5~0.7，优选为0.6。所述步骤S4中真空辅助侵染的方法为：将装有外植体和发根农杆菌菌悬液的三角瓶置于真空干燥器内，用无油活塞真空泵抽去空气形成0.08MPa的真空度。所述步骤S4中共培养基的成分为：1/2MS基本培养基+0.02~0.04mg/L硫酸镨+3.4~4.0mg/L聚乙烯吡咯烷酮+2.6~3.2mg/L陈皮素+13~16mg/L半胱氨酸盐酸盐+30~40ml/L桑叶汁+0.17~0.21mg/L三十烷醇+280~300μmol/L茉莉酸甲酯+180~200μmol/L乙酰丁香酮+3~4g/L植物凝胶，pH调节本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种黄连毛状根的高效诱导方法，其特征在于，具体包括如下步骤：S1、无菌组培苗的获得选取生长健壮的黄连植株，用流动的自来水冲洗30min，在净化工作台中切取植株上带芽茎段，用无菌水清洗2~3次，再用75%乙醇浸泡30~50s，无菌水洗去残留，最后用0.2%升汞浸泡8~10min，无菌水洗去残留；消毒后的茎段置于无菌滤纸上吸干表面的水分，然后接种到含有0.5mg/LNAA、0.1mg/L6‑BA的MS固体培养基上，置于适宜条件下培养直到长成具有真叶的无菌组培苗；S2、外植体的预培养在无菌条件下，将黄连无菌组培苗的真叶剪下，切成大小约0.5cm2的小块作为外植体接种到预培养基上，置于23~25℃、黑暗条件下培养 2~3d，培养期间每天于同一时间段对外植体依次进行TDP辐照和 60Coγ射线辐照的双重处理；S3、发根农杆菌的活化将发根农杆菌ACCC10060的菌种划线接种到YEB 固体培养基上，置于28℃、黑暗条件下活化3次，挑取固体培养基上的单菌落接种到YEB液体培养基中，置于28℃、200r/min、黑暗条件下振荡培养至对数生长期，4℃下3500r/min离心10min收集菌体，并用MS液体培养基重悬、稀释制成菌悬液；S4、毛状根的诱导与除菌外植体预培养结束后转移至发根农杆菌菌悬液中进行真空辅助侵染15~20min，将外植体取出用无菌滤纸吸干表面多余的菌液，接种到共培养基上共培养3~4d，然后取出用无菌水冲洗后转接到除菌培养基上，进行除菌培养，每7d转接一次，并逐渐降低除菌培养基中抗生素浓度，直到培养基上无菌落出现，再将长度为2~3cm、生长迅速的毛状根单根切下转接到新鲜的除菌培养基上，继续进行除菌培养，彻底去除发根农杆菌；S5、毛状根的液体培养将彻底除菌的毛状根接种到1/2MS液体培养基中，置于21~23℃、800~1000lx散射光照的条件下连续培养，每20d左右继代一次，获得大量生长的毛状根；S6、毛状根的PCR检测采用CTAB法提取黄连无菌组培苗总DNA作为阴性对照，同法提取上述毛状根总DNA作为检测模板，采用碱解法提取发根农杆菌质粒 DNA作为阳性对照，检测目的基因为rolB，进行PCR扩增后产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。...

【技术特征摘要】
1.一种黄连毛状根的高效诱导方法，其特征在于，具体包括如下步骤：S1、无菌组培苗的获得选取生长健壮的黄连植株，用流动的自来水冲洗30min，在净化工作台中切取植株上带芽茎段，用无菌水清洗2~3次，再用75%乙醇浸泡30~50s，无菌水洗去残留，最后用0.2%升汞浸泡8~10min，无菌水洗去残留；消毒后的茎段置于无菌滤纸上吸干表面的水分，然后接种到含有0.5mg/LNAA、0.1mg/L6-BA的MS固体培养基上，置于适宜条件下培养直到长成具有真叶的无菌组培苗；S2、外植体的预培养在无菌条件下，将黄连无菌组培苗的真叶剪下，切成大小约0.5cm2的小块作为外植体接种到预培养基上，置于23~25℃、黑暗条件下培养2~3d，培养期间每天于同一时间段对外植体依次进行TDP辐照和60Coγ射线辐照的双重处理；S3、发根农杆菌的活化将发根农杆菌ACCC10060的菌种划线接种到YEB固体培养基上，置于28℃、黑暗条件下活化3次，挑取固体培养基上的单菌落接种到YEB液体培养基中，置于28℃、200r/min、黑暗条件下振荡培养至对数生长期，4℃下3500r/min离心10min收集菌体，并用MS液体培养基重悬、稀释制成菌悬液；S4、毛状根的诱导与除菌外植体预培养结束后转移至发根农杆菌菌悬液中进行真空辅助侵染15~20min，将外植体取出用无菌滤纸吸干表面多余的菌液，接种到共培养基上共培养3~4d，然后取出用无菌水冲洗后转接到除菌培养基上，进行除菌培养，每7d转接一次，并逐渐降低除菌培养基中抗生素浓度，直到培养基上无菌落出现，再将长度为2~3cm、生长迅速的毛状根单根切下转接到新鲜的除菌培养基上，继续进行除菌培养，彻底去除发根农杆菌；S5、毛状根的液体培养将彻底除菌的毛状根接种到1/2MS液体培养基中，置于21~23℃、800~1000lx散射光照的条件下连续培养，每20d左右继代一次，获得大量生长的毛状根；S6、毛状根的PCR检测采用CTAB法提取黄连无菌组培苗总DNA作为阴性对照，同法提取上述毛状根总DNA作为检测模板，采用碱解法提取发根农杆菌质粒DNA作为阳性对照，检...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵静，
申请(专利权)人：赵静，
类型：发明
国别省市：山西,14