海藻原生质体分离培养和再生植株的方法技术

本发明专利技术提供海藻原生质体分离培养和再生植株的方法，属于藻类培养领域，具体方法为：选择颜色正常、无腐烂、生长旺盛的藻体，用毛刷清理藻体表面污泥、杂藻和其它附属杂质，用HgCl2溶液消毒，接着使用消毒海水冲洗干净，切取新鲜藻体顶端幼嫩部分，用滤纸吸干表面水分，将其剪切或研磨成细小的组织块或小的分枝，先在酒石酸钾钠和聚乙烯吡咯烷酮混合溶液中浸泡，再利用海藻工具酶溶液进行消化酶解，然后经离心沉淀，获得海藻体细胞原生质；将原生质体培养得到再生细胞壁的细胞，进一步培养即可得到再生植株。本发明专利技术提供一种育苗周期短、苗种繁育效率高的海藻的培养方法，它能够解决无性生殖类海藻苗种保种和繁育的问题，可用于生产性育苗。

【技术实现步骤摘要】
海藻原生质体分离培养和再生植株的方法
本专利技术属于藻类培养方法领域，具体涉及海藻原生质体分离培养和再生植株的方法。
技术介绍
藻类虽无花、果、种子等构造来繁衍后代，却有各式各样的生殖方式来适应环境。在无性生殖方面，有些细胞可以直接一分为二，如水绵，可以断成数段，每段再各自成长为独立个体；有的藻体可以产生许多有鞭毛的孢子，可自由游动，每一孢子成熟后各自长成为一新的个体；在环境不良时，有些藻类可产生厚壁的休眠孢子，等环境适宜时，再萌芽生长成新的个体。在有性生殖方面，有些藻类可产生雌、雄配子，经由交配后才长成新的个体。现有公开号为CN102144544A的中国专利技术专利，公开了一种麒麟菜属海藻原生质体分离培养和再生植株的方法，其主要是根据海藻体细胞发育的全能性，利用海藻工具酶分解麒麟菜组织，游离出体细胞原生质体，获得再生细胞壁的体细胞和细胞系，然后将其培养得到再生植株；然而，该专利技术酶解效率低，且原生质体培养条件粗略，不利于提高苗种繁育效率。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供海藻原生质体分离培养和再生植株的方法，提供一种育苗周期短、苗种繁育效率高的海藻的培养方法，它能够解决无性生殖类海藻苗种保种和繁育的问题，可用于生产性育苗。本专利技术为实现上述目的所采取的技术方案为：海藻原生质体分离培养和再生植株的方法，主要是根据海藻体细胞发育的全能性，利用海藻工具酶分解海藻组织，游离出体细胞原生质体，获得再生细胞壁的体细胞和细胞系，然后将其培养得到再生植株。具体步骤如下：步骤一、选择颜色正常、无腐烂、生长旺盛的藻体，用毛刷清理藻体表面污泥、杂藻和其它附属杂质，用0.005-0.008％的HgCl2溶液消毒5-10s，接着使用消毒海水冲洗干净，切取新鲜藻体顶端幼嫩部分，用滤纸吸干表面水分，将其剪切或研磨成细小的组织块或小的分枝，先在酒石酸钾钠和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)混合溶液中浸泡2-3h后，再利用海藻工具酶溶液进行消化酶解，然后经离心沉淀，获得海藻体细胞原生质；步骤二、将原生质体培养得到再生细胞壁的细胞，进一步培养即可得到再生植株。作为优选，酒石酸钾钠和PVP分别配制成浓度为0.1-0.5M和3-6M的溶液，然后按体积比1:3-5混合而成；酒石酸钾钠和PVP相互协同，能够使细胞壁表面纤维素发生膨胀，从而加速细胞壁溶解或破裂造成细胞质壁分离，同时能够提高细胞膜的强韧度，最终能够提高藻体酶解效率和确保获得的原生质体的完整性。作为优选，原生质体分离的操作为：用250-400目筛绢过滤细胞混合液，除去未消化的细胞、细胞团、碎片；取上清液500-850rpm离心8-10min，使单细胞(原生质体)下沉，细胞碎片留在上清液中，弃去上清液，用含有1.0-1.2M葡萄糖的消毒海水进行冲洗和离心2-3次，收集沉淀即得海藻原生质体。作为优选，海藻工具酶为海螺酶或纤维素酶或两者的组合；更优选地，海螺酶的制备方法为：将海螺洗净暂养于消毒海水中饥饿2-3天，去壳取其消化腺，研磨至匀浆，10000-15000rpm离心5-10min，弃去沉淀，上清液中加入-10～-20℃预冷的丙酮，离心弃去沉淀，再重复加入丙酮离心收集沉淀得原酶液，于-5～-20℃保存备用；原酶液使用时用海水稀释至15-25％；纤维素酶的配制方法为：用40-60mmol/L的柠檬酸或醋酸缓冲液(pH4.5-5.0)溶解，浓度为10-15％，其中醋酸缓冲液用消毒海水配制。作为优选，海藻工具酶使用时，加入渗透压稳定剂，渗透压稳定剂选自甘露醇、山梨醇、葡萄糖、蔗糖、KCl、NaCl中的一种；其中，醇类和糖类的适宜浓度为1.2-2.6M，KCl、NaCl的适宜浓度为0.5-0.8M。作为优选，酶解的条件为：pH为5.5-7.5，15-40℃下酶解2-4.5h。作为优选，原生质体培养方式为：先将海藻酸钠和原生质体等量混合滴于氯化钙溶液中形成固定，再接种到液体培养基中培养；先保持温度22-26℃下暗培养5-7天，然后转为光照培养，光照时间为8-10h/d，光强为2500-3000Lx，每7天更换一半培养基；其中，液体培养基为含萘乙酸和2,4-氯苯氧乙酸的PES培养基，并以甘露醇和葡萄糖保持培养基渗透压；利用氯化钙与海藻酸根离子螯合形成不溶于水的海藻酸钙凝胶，对细胞进行固定，能有效阻止原生质体发生粘连，且对原生质体可进行定点定位观察，追踪其发育过程，有利于提高细胞分裂速度。作为优选，原生质体培养过程，当细胞进行第一次分裂后，在培养基中添加色氨酸和抗坏血酸钠，并调节培养基pH为5.5-5.8，继续培养；色氨酸和抗坏血酸钠的添加量为培养基重量的1-5％和0.5-2％；色氨酸和抗坏血酸钠的特殊存在，一是有利于提高原生质体的分裂频率，加速细胞分裂形成丝状体、叶状体或愈伤组织，进而分化生成植株；二是能够有效防止原生质体培养过程中可能产生的酚类物质等发生氧化，保持分裂细胞内活性物质的稳定性，提高细胞的活力，促进原生质体分化发育，缩短育苗周期的同时保持较高的苗种繁育效率。本专利技术的有益效果为：1)本专利技术利用海藻工具酶对藻体进行消化酶解前，先对藻体进行预处理：采用酒石酸钾钠和PVP浓度分别为0.1-0.5M和3-6M配成的混合溶液浸泡藻体；酒石酸钾钠和PVP相互协同，能够使细胞壁表面纤维素发生膨胀，从而加速细胞壁溶解或破裂造成细胞质壁分离，同时能够提高细胞膜的强韧度，最终能够提高藻体酶解效率和确保获得的原生质体的完整性；2)本专利技术原生质体的培养方式采用：先将海藻酸钠和原生质体等量混合滴于氯化钙溶液中形成固定，再接种到液体培养基中培养；利用氯化钙与海藻酸根离子螯合形成不溶于水的海藻酸钙凝胶，对细胞进行固定，能有效阻止原生质体发生粘连，且对原生质体可进行定点定位观察，追踪其发育过程，有利于提高细胞分裂速度；3)本专利技术在原生质体培养过程，当细胞进行第一次分裂后，在培养基中添加色氨酸和抗坏血酸钠，色氨酸和抗坏血酸钠的特殊存在，一是有利于提高原生质体的分裂频率，加速细胞分裂形成丝状体、叶状体或愈伤组织，进而分化生成植株；二是能够有效防止原生质体培养过程中可能产生的酚类物质等发生氧化，保持分裂细胞内活性物质的稳定性，提高细胞的活力，促进原生质体分化发育，缩短育苗周期的同时保持较高的苗种繁育效率。本专利技术采用了上述技术方案提供范文，弥补了现有技术的不足，设计合理，操作方便。具体实施方式以下结合实施例对本专利技术作进一步详细描述：实施例1：海藻藻种选择麒麟菜。海藻原生质体分离培养和再生植株的方法，主要是根据海藻体细胞发育的全能性，利用海藻工具酶分解海藻组织，游离出体细胞原生质体，获得再生细胞壁的体细胞和细胞系，然后将其培养得到再生植株。具体步骤如下：(1)选择颜色正常、无腐烂、生长旺盛的藻体，用毛刷清理藻体表面污泥、杂藻和其它附属杂质，用0.005％的HgCl2溶液消毒5s，接着使用消毒海水冲洗干净，切取新鲜藻体顶端幼嫩部分，用滤纸吸干表面水分，将其剪切或研磨成细小的组织块或小的分枝，先在酒石酸钾钠和PVP混合溶液中浸泡2h后，再利用海藻工具酶溶液进行消化酶解，然后经离心沉淀，获得海藻体细胞原生质；这里，酒石酸钾钠和PVP分别配制成浓度为0.1M和3M的溶液，然后按体积比1:3混合而成；酒石酸钾钠和PVP相互协同，能够使细胞壁表面本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.海藻原生质体分离培养和再生植株的方法，其特征在于：利用海藻工具酶分解海藻组织，得到体细胞原生质体，经由培养得再生植株；所述海藻工具酶对海藻组织进行酶解前，先用酒石酸钾钠和聚乙烯吡咯烷酮的混合溶液浸泡藻体。

【技术特征摘要】
1.海藻原生质体分离培养和再生植株的方法，其特征在于：利用海藻工具酶分解海藻组织，得到体细胞原生质体，经由培养得再生植株；所述海藻工具酶对海藻组织进行酶解前，先用酒石酸钾钠和聚乙烯吡咯烷酮的混合溶液浸泡藻体。2.根据权利要求1所述的海藻原生质体分离培养和再生植株的方法，其特征在于：所述酒石酸钾钠和聚乙烯吡咯烷酮的浓度分别为0.1-0.5M和3-6M，并按体积比1:3-5混合而成。3.根据权利要求1所述的海藻原生质体分离培养和再生植株的方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤一、选择颜色正常、无腐烂、生长旺盛的藻体，用毛刷清理藻体表面污泥、杂藻和其它附属杂质，用0.005-0.008%的HgCl2溶液消毒5-10s，接着使用消毒海水冲洗干净，切取新鲜藻体顶端幼嫩部分，用滤纸吸干表面水分，将其剪切或研磨成细小的组织块或小的分枝，先在酒石酸钾钠和聚乙烯吡咯烷酮混合溶液中浸泡2-3h后，再利用海藻工具酶溶液进行消化酶解，然后经离心沉淀，获得海藻体细胞原生质；步骤二、将原生质体培养得到再生细胞壁的细胞，进一步培养即可得到再生植株。4.根据权利要求2所述的海藻原生质体分离培养和再生植株的方法，其特征在于：所述原生质体分离的操作为：用250-400目筛绢过滤细胞混合液，除去未消化的细胞、细胞团、碎片；取上清液500-850rpm离心8-10min，使原生质体下沉，细胞碎片留在上清液中，弃去上清液，用含有1.0-1.2M葡萄糖的消毒海水进行冲洗和离心2-3次，收集沉淀即得海藻原生质体。5.根据权利要求2所述的海藻原生质体分离培养和再生植株的方法，其特征在于：所述海藻工具酶为海螺酶或纤维素酶或两者的组合；其中，海螺酶的制备方法为：将海螺洗净暂养于消毒海水中饥饿2-...

【专利技术属性】
技术研发人员：王斌，张建设，杨静静，
申请(专利权)人：浙江海洋大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33