一种油橄榄体细胞胚胎发生及植株再生方法技术

本发明专利技术公开了一种油橄榄体细胞胚胎发生及植株再生方法，包括如下步骤：首先将油橄榄果实去除果肉，取出果核，并去除果核上的残余果肉，将果核干燥后放入温水中浸泡后去除，取出种仁；再将取出的种仁依次采用酒精和升汞浸泡后用清水冲洗，再分离胚和子叶，然后将分离的胚和子叶分别置于油橄榄胚性愈伤组织诱导培养基上进行暗培养；再将获得的胚性愈伤组织置于体细胞胚胎发生培养基进行暗培养；待愈伤组织表面长出胚状体，并发育至子叶胚时期后，将其进行光照培养，直至形成完整再生植株；将再生植株驯化后移栽。本发明专利技术油橄榄体细胞胚胎发生及植株再生方法可以高效便捷地获得高质量体细胞胚胎再生植株。

【技术实现步骤摘要】
一种油橄榄体细胞胚胎发生及植株再生方法
本专利技术涉及植株培养
，更具体的说是涉及一种油橄榄体细胞胚胎发生及植株再生方法。
技术介绍
随着社会经济发的发展，橄榄油的营养、保健和医疗价值逐渐被人们认识和接受，橄榄油消费量急剧增长，巨大的市场空间和良好的经济效益促进油橄榄在多个省份开展种植，从而推动种苗需求的旺盛。目前油橄榄种苗繁殖常采用扦插繁殖方式，该方法繁殖速度快，成本较低，但是其受品种间遗传特性影响生根率存在差异；同时扦插苗无明显主根，根系生长较浅，且根系喜好中性偏碱的土壤，对于土质有较高要求，也在一定程度限制了油橄榄的种植。嫁接繁殖通过对砧木的选择可以提高土壤适应性，因此有必要开展特异性砧木培育研究，筛选合适砧木类型。实生砧木因根系有明显主根，常作为砧木培育的主要方向，其来源主要依靠实生种子获得，但由于油橄榄实生种子萌发后生长较为缓慢，存在休眠现象，且对果肉处理要求较高，处理不善，极易导致实生种子萌发失败，影响且限制了实生砧木的大规模培育。体细胞胚胎具有类似合子胚萌发机制，能自主生成根系，通过诱导体胚发生能在无限制条件下培养油橄榄砧木，且能保证基因型的一致性，为后期亲和性砧木培育提供技术支持。因此，如何提供一种高效便捷地获得高质量体细胞胚胎再生植株的油橄榄体细胞胚胎发生及植株再生方法是本领域技术人员亟需解决的问题。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供了一种油橄榄体细胞胚胎发生及植株再生方法。为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种油橄榄体细胞胚胎发生及植株再生方法，包括如下步骤：1)材料获取：将油橄榄果实去除果肉，取出果核，然后将所述果核用细沙反复进行揉刷，充分去除果核上的残余果肉，将果核干燥后放入温水中浸泡，再将果核破开取出种仁；2)灭菌：将所述步骤1)中取出的种仁清洗后吸干水分，进行酒精浸泡后再采用升汞浸泡，然后用清水冲洗后取出种仁置于滤纸上，用尖嘴镊和手术刀分离胚和子叶；3)将分离的胚和子叶分别置于油橄榄胚性愈伤组织诱导培养基上进行暗培养；4)将所述步骤3)暗培养获得的胚性愈伤组织置于体细胞胚胎发生培养基进行暗培养；5)待所述步骤4)中愈伤组织表面长出胚状体，并发育至子叶胚时期后，将其转移至光照培养室中进行光照培养，继续培养形成完整再生植株；6)将再生植株驯化后移栽。本专利技术的有益效果是：本专利技术中采用成熟的油橄榄种仁，在无菌条件下分离出子叶(多倍体)和胚(双倍体)进行体细胞胚胎发生，有效的解决了无法直接用油橄榄外植体体细胞胚胎发生和植株再生技术的难关，并且本专利技术体细胞胚胎发生及植株再生方法周期短、繁殖率高、成本低廉，还可以完整保留母本所有性状。进一步，步骤1)中的干燥为：将果核放置在避免直射阳光照射、遮阴通风的位置放置28-31天。进一步，步骤1)中的温水浸泡：在60-70℃的温水中浸泡22-25h。进一步，步骤2)中的酒精浸泡为：采用70-80％的酒精浸泡20-30s。进一步，步骤2)中的升汞浸泡为：采用0.08-0.1％的升汞浸泡8-10min。采用上述进一步方案的有益效果是：将果核在60-70℃的温水中浸泡22-25h后，可以快速的去除果核、不伤果仁；而依次采用上述进一步方案中的酒精、升汞浸泡，可以在保证不损害种仁的情况下，有效的、彻底的对种仁表面进行杀菌消毒，使得种仁处于无菌状态。进一步，步骤3)中油橄榄胚性愈伤组织诱导培养基为：MS为基础培养基，MS基础培养基中添加2,4D1.5～3mg/L+6，BA0.2mg/L，蔗糖30g/L，pH5.8。进一步，步骤3)中暗培养温度为22-25℃，诱导培养时间为25～35天。进一步，步骤4)中体细胞胚胎发生培养基为：MS为基础培养基，MS基础培养基中添加KT0.2mg/L+6,BA0.1～0.5mg/L，IAA0.1～0.5mg/L+蔗糖35～50g/L，pH5.8。进一步，步骤4)所述暗培养温度为25℃，培养时间为16-30天。进一步，步骤5)中所述光照培养的培养基为：以WPM基本培养基，添加加蔗糖30g/L，pH5.8，光照强度5000lux；所述光照培养时间为60～90天。经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本专利技术公开提供了一种油橄榄体细胞胚胎发生及植株再生方法，与现有技术相比，本专利技术的油橄榄体细胞胚胎固体培养植株再生方法，通过固体培养方式，形成稳定的油橄榄体细胞胚胎发生系统，从而更加高效便捷地获得高质量体细胞胚胎再生植株。建立出稳固、高频、操作简单、苗木抗性良好的油橄榄固体培养基体细胞胚胎发生体系。具体实施方式下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。其中在专利技术实施例中的2,4D为生长素或者生长素类似物；6,BA为6苄基腺嘌呤,细胞分裂素；KT为细胞分裂素；IAA为吲哚乙酸，WPM为本领域常规使用的WPM基本培养基：MS为本领域常规使用的MS基本培养基：实施例1油橄榄体细胞胚胎发生及植株再生方法，包括以下步骤：1)材料获取：将收集的基因型为鄂植8号的油橄榄果实去除果肉，然后用细沙反复进行揉刷，充分去除果核上的残余果肉。阴干后放置30天后，将果核放入60℃的温水中浸泡24h后去除，将果核破开，取出种仁；2)灭菌：将取出的种仁用洗洁精清洗30min后，用清水冲洗2h后吸干水分，放入至75％酒精中20s后倒出，倒入0.1％的升汞浸泡10min，清水清洗3次后取出种仁置于滤纸上，用尖嘴镊和手术刀分离胚和子叶；3)将分离的胚和子叶分别置于以MS+蔗糖30g/L为基本培养基，附加2,4D1.5mg/L+6,BA0.2mg/L+蔗糖30g/L组成油橄榄胚性愈伤组织诱导培养基，pH5.8，在22℃进行暗培养诱导胚性愈伤组织，诱导30天，获得愈伤组织；4)将直径为0.5cm，重量为1.6g/皿的愈伤组织，接种在以MS为基本培养基，附加KT0.2mg/L+6,BA0.5mg/L+IAA0.1mg/L+蔗糖35g/L的培养基上，总共接种3皿，每皿接5块愈伤组织，在25℃暗培养培养，诱导体细胞胚胎发生；5)待从愈伤组织表面长出胚状体，并发育至子叶胚时期后，将材料转移至光照培养室组培瓶中，以WPM基本培养基，附加蔗糖30g/L，pH5.8，在光照强度5000lux下培养时间为85天，获得再生植株。6)将再生植株驯化后移栽到直径为6厘米的装有轻基质(泥炭：蛭石：珍珠岩＝3:1:2)小盆中；随后进行正常的室外栽培。实施例2油橄榄体细胞胚胎发生及植株再生方法，包括以下步骤：1)材料获取：将收集的基因型为城固32号的油橄榄果实去除果肉，然后用细沙反复进行揉刷，充分去除果核上的残余果肉。阴干后放置28天后，将果核放入70℃的温水中浸泡20h后去除，将果核破开，取出种仁；2)灭菌：将取出的种仁用洗洁精清洗30min后，用清水冲洗2h后吸干水分，放入至80％酒精中25s后倒出，倒入0.08％的升汞浸泡8min，清水清洗2次后取出种仁置于滤纸上，用尖嘴镊和手术刀分离胚和子叶；3)将分离的胚和子叶分别置于以MS+蔗糖30g/L为基本培养基，附加2,4D2mg/L+6,BA本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种油橄榄体细胞胚胎发生及植株再生方法，其特征在于，包括如下步骤：1)材料获取：将油橄榄果实去除果肉，取出果核，然后将所述果核用细沙反复进行揉刷，充分去除果核上的残余果肉，将果核干燥后放入温水中浸泡后，再将果核破开取出种仁；2)灭菌：将所述步骤1)中取出的种仁清洗后吸干水分，进行酒精浸泡后再采用升汞浸泡，然后用清水冲洗后取出种仁置于滤纸上，用尖嘴镊和手术刀分离胚和子叶；3)将分离的胚和子叶分别置于油橄榄胚性愈伤组织诱导培养基上进行暗培养；4)将所述步骤3)暗培养获得的胚性愈伤组织置于体细胞胚胎发生培养基进行暗培养；5)待所述步骤4)中愈伤组织表面长出胚状体，并发育至子叶胚时期后，将其转移至光照培养室中进行光照培养，继续培养形成完整再生植株；6)将再生植株驯化后移栽。

【技术特征摘要】
1.一种油橄榄体细胞胚胎发生及植株再生方法，其特征在于，包括如下步骤：1)材料获取：将油橄榄果实去除果肉，取出果核，然后将所述果核用细沙反复进行揉刷，充分去除果核上的残余果肉，将果核干燥后放入温水中浸泡后，再将果核破开取出种仁；2)灭菌：将所述步骤1)中取出的种仁清洗后吸干水分，进行酒精浸泡后再采用升汞浸泡，然后用清水冲洗后取出种仁置于滤纸上，用尖嘴镊和手术刀分离胚和子叶；3)将分离的胚和子叶分别置于油橄榄胚性愈伤组织诱导培养基上进行暗培养；4)将所述步骤3)暗培养获得的胚性愈伤组织置于体细胞胚胎发生培养基进行暗培养；5)待所述步骤4)中愈伤组织表面长出胚状体，并发育至子叶胚时期后，将其转移至光照培养室中进行光照培养，继续培养形成完整再生植株；6)将再生植株驯化后移栽。2.根据权利要求1所述的一种油橄榄体细胞胚胎发生及植株再生方法，其特征在于，所述步骤1)中的干燥为：将果核放置在避免直射阳光照射、遮阴通风的位置放置28-31天。.3.根据权利要求1所述的一种油橄榄体细胞胚胎发生及植株再生方法，其特征在于，所述步骤1)中所述温水浸泡：在60-70℃的温水中浸泡22-25h。4.根据权利要求1所述的一种油橄榄体细胞胚胎发生及植株再生方法，其特征在于，所述步骤2)中的酒精浸泡为：采用70-80％的酒精浸泡20-30s。5.根据权利要求1...

【专利技术属性】
技术研发人员：龙伟，姚小华，任华东，
申请(专利权)人：中国林业科学研究院亚热带林业研究所，
类型：发明
国别省市：浙江,33