一种提高苏尼特羊产羔数的单倍型遗传标记及其应用制造技术

本发明专利技术公开了利用GDF9基因提高苏尼特羊繁殖力的方法，由于‑332、‑534和‑779三个位点连锁不平衡，本方法利用PCR方法扩增苏尼特羊GDF9基因GenBank Accession Number为NC_019462的41771049到41771267位点核苷酸的片段(‑534位点)，并将扩增产物进行RFLP检测，若能在只214bp位置出现条带证明基因型为CC，如果在214bp、129bp和85bp处同时出现条带证明为杂合体基因型CT，如果在只129和85bp处出现条带则证明基因型为TT；CT(‑332位点)、AG(‑534位点)和CT(‑779位点)基因型苏尼特羊的繁殖力高于所述CT(‑332位点)、AA(‑534位点)和CC(‑779位点)基因型苏尼特羊。本发明专利技术利用PCR‑RFLP迅速、简便的检测单倍型遗传标记多态性,为利用分子标记辅助育种技术提高苏尼特羊繁殖力，提供了一个准确简便的方法。

A Haploid Genetic Marker for Increasing Lambing Number of Sunite Sheep and Its Application

The present invention discloses a method for improving the fecundity of Sunite sheep by using GDF9 gene. Due to the unbalanced linkage of 332, 534 and 779 loci, this method amplifies the nucleotide fragments of GenBank Accession Number of Sunite sheep GDF9 gene from 41771049 to 4171267 loci (534 loci) of NC_0162 by PCR, and detects the amplified products by RFLP, if only 214 BP loci can be detected. The present band proves that the genotype is CC. If a band appears simultaneously at 214 bp, 129 BP and 85 bp, it proves that the genotype is TT; if a band appears at only 129 BP and 85 bp, the genotype is TT; CT (332 locus), AG (534 locus) and CT (779 locus) genotype Sunite sheep have higher fecundity than the CT (2 locus), AA (534 locus) and CC (779 locus) genotype Sunite sheep. Sheep. The invention detects haplotype Genetic Marker Polymorphism quickly and conveniently by using PCR RFLP, and provides an accurate and simple method for improving the fecundity of Sunite sheep by using molecular marker assisted breeding technology.

【技术实现步骤摘要】
一种提高苏尼特羊产羔数的单倍型遗传标记及其应用
一种提高苏尼特羊产羔数的单倍型遗传标记及其应用。
技术介绍
GDF9(growthdifferentiationfactor9，GDF9)即生长分化因子9，与BMP15基因同属于转化生长因子β(TGFβ)超家族成员。绵羊的GDF9基因位于到5号染色体上，全长约2.5kb，其中包含2个外显子和1个内含子，外显子1长397bp，编码134个氨基酸，外显子2长968bp，编码456个氨基酸，内含子长1126bp。(SadighiM,BodensteinerKJ,BeattieAEetal.Geneticmappingofovinegrowthdifferentiationfactor9(GDF9)tosheepchromosome5.[J].AnimalGenetics,2002,33(3):244-245.)。苏尼特羊产于内蒙古自治区锡林郭勒盟苏尼特左旗和苏尼特右旗，有戈壁羊之称。其主要饲养方式为纯天然牧场自然放牧，气候特点为春季干旱多风、夏季炎热、冬季寒冷，主要饲养植物种类有沙葱、多根葱、小型针茅草等多达477种。苏尼特羊有很强的适应能力，在终年放牧不补任何伺料的条件下都能很快抓膘，而且肌肉丰满，体格壮大，肉质细嫩，无膻味，口感好，有较高的产肉性能。苏尼特羊肉富含人体所需要的各种氨基酸、脂肪酸、矿物质、维生素等，且蛋白质含量高、脂肪含量低，因此在国内外非常受欢迎。1986年苏尼特羊被锡林郭勒盟技术监督局批准为地方良种，1997年被内蒙古自治区人民政府正式命名为苏尼特羊，在2010年被列入全国优良畜种名录，2015年被列入国家级畜禽遗传保护名录。(高凤明，白乙尔图，刘金，孙彦军，邵志勇。苏尼特羊及羊肉的品质与营养。[J]中国畜牧兽医文摘，2014，30(12)：43-44.)。李碧侠等用PCR-SSCP技术分析了GDF9基因在小尾寒羊、湖羊、多赛特和萨福克4个绵羊品种的多态性，结果表明在湖羊、多赛特和萨福克羊GDF9基因外显子1编码区152bp处发生了A→G的突变，导致第51位氨基酸由天冬酰胺变为天冬氨酸，小尾寒羊没有发生该突变。(李碧侠，储明星，王金玉。绵羊GDF9基因PCR-SSCP分析。[J]遗传学报，2003，30(4)：307-310.)。Hanrahan等用PCR-SSCP和直接测序的方法在Cambridge绵羊和Belclare绵羊GDF9基因中发现了G1～G8共8个突变，其中有3个核苷酸改变(分别位于编码区471bp处的C→T[G2突变]、477bp处的G→A[G3突变]和978bp处A→G[G5突变])没有导致氨基酸变化；4个G→A的突变导致了氨基酸变化，分别是位于编码区260bp处的突变导致第87位由精氨酸变为组氨酸(G1突变)，编码区721bp处的突变导致第241位由谷氨酸变为赖氨酸(G4突变)，编码区994bp处的突变导致第332位由缬氨酸变为异亮氨酸(G6突变)，编码区1111bp处的突变导致第371位由缬氨酸变为甲硫氨酸(G7突变)；另外编码区1184bp处的C→T碱基突变导致第395位由丝氨酸变为苯丙氨酸(G8突变，FecGH)。(HanrahanJP,GreganSM,MulsantPetal.MutationsinthegenesforoocytederivedgrowthfactorsGDF9andBMP15areassociatedwithbothincreasedovulationrateandsterilityinCambridgeandBelclaresheep(Ovisaries).[J].BiologyofReproduction,2004,70(4):900-909.)。管峰等用PCR-RFLP方法研究GDF9基因G8突变在湖羊、夏洛来、多赛特、萨福克、中国美利奴肉用多胎品系、中国美利奴羊和罗姆尼7个绵羊群体中的分布，结果发现仅在湖羊群体中检测到G8纯合突变，但发生率极低(0.645％，2/310)。(管峰，艾君涛，庞训胜等。绵羊GDF9和BMP15基因多态性检测。[J]生命科学研究，2005，9(2)：184-188.)。杨晶采用PCR-SSCP方法分析GDF9基因在小尾寒羊和多赛特羊中的多态性，结果表明在小尾寒羊和多赛特羊GDF9基因外显子2中都检测到了G3突变和编码区729bp处的G→T突变，后者导致243位氨基酸由谷氨酰胺变为组氨酸。(杨晶。小尾寒羊GDF9基因和BMP15基因多态性及其与高繁殖力关系的研究。[D]北京：中国农业科学院，2006.)。高丽霞用PCR-SSCP方法分析GDF9基因外显子2在小尾寒羊、滩羊、同羊和欧拉羊4个绵羊群体中的多态性，结果发现在这4个绵羊品种GDF9基因外显子2编码区558bp和第692bp处都发生了T→C的突变，其中后者导致231位氨基酸由异亮氨酸变为苏氨酸。(高丽霞。小尾寒羊TGF-β1和GDF9基因多态性及其与繁殖力关系的研究。[D]北京：中国农业科学院，2007.)。Nicol等研究发现，FecTT突变是冰岛Thoka绵羊GDF9基因外显子2编码区1279位发生的A→C的突变，FecTT突变纯合子Thoka母羊不育，突变杂合子母羊产羔数比野生型多0.6只。该突变对Thoka绵羊生殖的影响主要表现在三个方面。第一：解剖发现，FecTT突变纯合子(TT)Thoka母羊都存在严重的生殖道畸形现象。表现为子宫没有发育，卵巢小而且未被激活，没有排卵前卵泡和黄体等。第二：TT型母羊卵巢的皮质区域含有大量的原始卵泡，其中许多都被一至两层颗粒细胞包围，且大多数呈现异常形态，也有极少数卵泡被两到四层不对称的颗粒细胞包围。一些TT型卵泡含有相当于正常窦状卵泡大小的卵母细胞，但在高倍镜下观察发现许多卵泡不是已完全瓦解，就是正在瓦解；另一些异常的卵泡中卵母细胞聚集成簇，并被一层颗粒细胞包围。而野生型母羊(++)的卵巢中含有发育到各个阶段的卵泡，在卵泡皮质区域仅可见极少数原始卵泡。第三：与++型母羊相比，FecTT突变使TT型母羊血浆中的促卵泡激素和黄体生成素水平增加，而抑制素A和雌二醇水平下降。TT型母羊颗粒细胞无明显增殖，而在++型母羊中，当卵母细胞增大到直径达80mm时，就会增殖出现许多颗粒和卵泡膜细胞。(NicolL,BishopSC,Pong-WongRetal.Homozygosityforasinglebase-pairmutationintheoocyte-specificGDF9generesultsinsterilityinThokasheep.[J].Reproduction,2009,138(6):921-933.)。畅静桃等采用PCR-SSCP和测序的方法在小尾寒羊、白萨福克、特克塞尔和藏羊中都检测到GDF9基因G2突变。(畅静桃，罗玉柱，胡江。绵羊高繁殖力候选基因GDF9的多态性分析。[J]甘肃农业大学学报，2009，44(2)：30-33.)。陈勇等用PCR-SSCP方法在小尾寒羊，中国美利奴(新疆型)绵羊多胎品系、肉用品系、体大品系，萨福克，无角多赛特，中国美利奴(新疆型)和德国肉用美利奴8个绵羊群体中都检测到了GDF9基因的G4突变本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测苏尼特羊繁殖力的方法，是检测待测苏尼特羊基因组中的GDF9基因编码区启动子上游332bp处是否存在一个C→T的突变，534bp是否存在A→G的突变，799bp处是否存在一个C→T的突变，以确定苏尼特羊个体在上述三个位点的基因型，然后通过任意位点的基因型筛选种用苏尼特羊；所述的GDF9基因的核苷酸序列NCBI Reference Sequence为NC_019462.2的羊5号染色体，第41770600bp到41771399bp区域。所述确定苏尼特羊的基因型的前提为：苏尼特羊基因组中的GDF9基因编码区启动子上游332bp处的C→T突变,534bp的A→G突变，799bp处的C→T突变，为连锁不平衡突变(linkage disequilibrium，LD)，既不同座位上多个基因同时遗传的频率明显高于预期的随机频率的现象。所述确定苏尼特绵羊的基因型的方法为：当苏尼特羊基因组中的GDF9基因编码区启动子上游第332位核苷酸为C、534位核苷酸A、799位核苷酸为C时，其基因型为野生型CC、AA和CC；当苏尼特羊基因组中的基因编码区启动子上游第332位核苷酸为T、534位核苷酸为G、799位核苷酸为T时，其基因型为杂合突变CT、AG和CT，本次实验群体中未发现纯合突变；通过基因型确定苏尼特羊繁殖力的方法为：所述CT(‑332位点)、AG(‑534位点)和CT(‑779位点)基因型苏尼特羊的繁殖力高于所述CT(‑332位点)、AA(‑534位点)和CC(‑779位点)基因型苏尼特羊。...

【技术特征摘要】
1.一种检测苏尼特羊繁殖力的方法，是检测待测苏尼特羊基因组中的GDF9基因编码区启动子上游332bp处是否存在一个C→T的突变，534bp是否存在A→G的突变，799bp处是否存在一个C→T的突变，以确定苏尼特羊个体在上述三个位点的基因型，然后通过任意位点的基因型筛选种用苏尼特羊；所述的GDF9基因的核苷酸序列NCBIReferenceSequence为NC_019462.2的羊5号染色体，第41770600bp到41771399bp区域。所述确定苏尼特羊的基因型的前提为：苏尼特羊基因组中的GDF9基因编码区启动子上游332bp处的C→T突变,534bp的A→G突变，799bp处的C→T突变，为连锁不平衡突变(linkagedisequilibrium，LD)，既不同座位上多个基因同时遗传的频率明显高于预期的随机频率的现象。所述确定苏尼特绵羊的基因型的方法为：当苏尼特羊基因组中的GDF9基因编码区启动子上游第332位核苷酸为C、534位核苷酸A、799位核苷酸为C时，其基因型为野生型CC、AA和CC；当苏尼特羊基因组中的基因编码区启动子上游第332位核苷酸为T、534位核苷酸为G、799位核苷酸为T时，其基因型为杂合突变CT、AG...

【专利技术属性】
技术研发人员：李光鹏，佟彬，王嘉鹏，白春玲，刘志刚，吕菲菲，
申请(专利权)人：内蒙古大学，内蒙古小黑头羊牧业有限责任公司，
类型：发明
国别省市：内蒙古,15