一种靶向全人源化mesothelin的嵌合抗原受体的方法和用途技术

本发明专利技术涉及一种靶向全人源化间皮素的嵌合抗原受体及其用途。具体而言，本发明专利技术提供一种多核苷酸序列，选自：(1)含有依次连接的抗间皮素单链抗体的编码序列、人CD8α铰链区的编码序列、人CD8α跨膜区的编码序列、人CD28胞内区的编码序列、人41BB胞内区的编码序列、人CD3ζ胞内区的编码序列、任选的EGFR的含胞外结构域III和胞外结构域IV的片段的编码序列；和(2)(1)所述多核苷酸序列的互补序列。本发明专利技术还提供相关的融合蛋白、含所述编码序列的载体，以及所述融合蛋白、编码序列、载体的用途。本发明专利技术制备的CART细胞带有tEGFR组件其具有体内示踪和安全开关的作用。

A method and application of chimeric antigen receptor targeting humanized mesothelin

The present invention relates to a chimeric antigen receptor targeting human mesothelin and its application. Specifically, the present invention provides a polynucleotide sequence selected from: (1) the coding sequence containing sequentially linked anti-mesothelin single chain antibodies, the coding sequence of human CD8alpha hinge region, the coding sequence of human CD8alpha transmembrane region, the coding sequence of human CD28 intracellular region, the coding sequence of human 41BB intracellular region, the coding sequence of human CD3 intracellular region, the coding sequence containing extracellular domain III and extracellular domain III of optional EGFR. The coding sequence of the fragment of the outer domain IV; and the complementary sequence of the polynucleotide sequence described in (2) (1). The invention also provides the relevant fusion protein, the carrier containing the coding sequence, and the use of the fusion protein, the coding sequence and the carrier. The prepared CART cells of the invention have a tEGFR module, which has the function of in vivo tracing and safety switch.

【技术实现步骤摘要】
一种靶向全人源化mesothelin的嵌合抗原受体的方法和用途
本专利技术属于嵌合抗原受体领域，具体涉及靶向间皮素的嵌合抗原受体及其用途。
技术介绍
胰腺癌(PancreaticCarcinoma)是临床上常见的消化系统恶性肿瘤，多见于50岁以上的人群。其发病率有明显的地区差异，近年来发病率呈逐渐上升趋势，在欧美国家已是第4位常见的恶性肿瘤，居消化道癌症死因的第2位，仅次于大肠癌,其发病隐匿，早期症状无特异性，手术切除率低。在肿瘤发生发展的进程中，很多基因的活化及其产物的表达起到了重要的作用，其内在确切的分子机制尚不完全明确，随着现代影像及内镜技术的飞速发展，对一些症状体征及影像表现较为明显的胰腺癌，明确诊断己没有太大困难，但此时大多己失去最佳手术时机，而对于一些早期患者诊断较难。因此寻求新的治疗手段，对于胰腺癌的治疗是当务之急。在肿瘤的浸润转移过程的研究方面，间皮素(Mesothelin)也是当前研究的热点。1996年Chang等利用宫颈癌HeLa细胞克隆出单克隆抗体识别的抗原，研究发现该抗原存在于正常间皮细胞，故命名为Mesothelin。肿瘤患者术后生存率低预后差的主要原因与它的浸润转移有关，肿瘤的浸润转移机制研究是目前的热点和难点。Mesothelin基因编码一种69kDa的前体蛋白，经加工形成一个40kDa的膜结合蛋白(即Mesothelin)和一个3lkDa称之为巨核细胞促进因子MPF的脱落片断。间皮素高表达于多种肿瘤组织中，卵巢癌患者血清中的MesothelinmRNA和蛋白质水平高表达，组织切片染色显示非粘蛋白卵巢癌中有66％呈间皮素阳性；在胸膜间皮瘤的检测中发现，15例确诊为上皮性间皮瘤的病例全都呈阳性，4例肉瘤性间皮瘤全为阴性；Argani等研究报道，切除的原发性胰腺癌中，免疫组化法检测表明60例有54例强阳性，而周围正常胰腺组织则无Mesothelin反应活性；在其他实体肿瘤分析中，官颈、头、颈、阴道、肺及食管的鳞癌冰冻切片中均可发现间皮素免疫活性，肺腺癌、子宫内膜癌、交界性滑膜肉瘤及结缔组织增生性小圆细胞肿瘤有少量间皮素表达，在乳腺癌，甲状腺癌、肾细胞癌、膀胱移细胞癌、黑色素癌及肝癌中仅有少许或没有Mesothelin表达。Mesothelin的生物学功能尚未明确。Pastan等构建了一种Mesothelin基因突变小鼠，这些基因突变小鼠与同胞的野生型小鼠生长和繁殖相同，并且二者的血小板计数没有统计学差异；有研究显示Mesothelin与CA125结合能介导细胞粘附，由此研究者们也认为CA125和Mesothelin在卵巢癌的转移扩散中可能起重要作用；另外，有研究亦表明，Mesothelin基因的表达受到Wnt等重要信号途径的调节，如在卵巢癌和胰腺癌中，Wnt信号转导途径持续激活促使Mesothelin表达增加。虽然。Mesothelin的功能及其致癌作用仍有待于进一步明确，但其在正常组织中的分布有限而在某些肿瘤组织高度表达的特征，因而Mesothelin可作为肿瘤特异性抗体治疗的靶向。嵌合抗原受体(ChimericAntigenReceptor-Tcell，CAR-T)T细胞是指经基因修饰后，能以MHC非限制性方式识别特定目的抗原，并且持续活化扩增的T细胞。2012年国际细胞治疗协会年会中指出生物免疫细胞治疗已经成为手术、放疗、化疗外的第四种治疗肿瘤的手段，并将成为未来肿瘤治疗必选手段。嵌合抗原受体(CAR)是CAR-T的核心部件，赋予T细胞HLA非依赖的方式识别肿瘤抗原的能力，这使得经过CAR改造的T细胞相较于天然T细胞表面受体TCR能够识别更广泛的目标。CAR的基础设计中包括一个肿瘤相关抗原(tumor-associatedantigen，TAA)结合区(通常来源于单克隆抗体抗原结合区域的scFV段)，一个胞外铰链区，一个跨膜区和一个胞内信号区。目标抗原的选择对于CAR的特异性、有效性以及基因改造T细胞自身的安全性来讲都是关键的决定因素。目前在ClinicalTrials.gov注册的抗MesothelinCAR-T细胞治疗临床试验有10项，主要针对胰腺癌、卵巢癌、胸膜瘤、肺癌以及乳腺癌等恶性肿瘤。在宾夕法尼亚大学开展的I期临床研究中，病人都是在接受过一线治疗后病情进一步发展，并且肿瘤组织表达Mesothelin，他们接受了瞬转CARmRNA的T细胞治疗。这种Mesothelin特异性的二代CAR具有CD3ξ和4-1BB共刺激因子结构域。这些Mesothelin特异性的CART存活期短，在两位病人中表现出了抗肿瘤作用，可见Mesothelin能够作为CART细胞识别的抗原，并且瞬转mRNA的方式也是可行的。另一项宾夕法尼亚大学开展的I期临床研究使用的是慢病毒转染的Mesothelin特异性CAR。这项开始于2014年7月的研究是针对耐化疗的恶性胰腺癌、上皮性卵巢癌和恶性上皮胸膜间皮瘤。在6位病人的早期研究结果中，4位病人在CART细胞输注28天后病情稳定。CART细胞输注没有引起急性副反应，并且相比mRNA瞬转，慢病毒转染构建的CART细胞的持续性得到提升。通过临床试验的开展以及对试验结果的分析，研究者们对抗MesothelinCAR-T细胞治疗方法在应用中的缺陷有了更深刻的认识，从而能进一步开展针对性的研究克服存在的问题。鉴于在实体瘤治疗中，促使CAR-T细胞最大效率地进入肿瘤组织是取得治疗功效的重要保证。根据胸膜间皮瘤细胞能大量分泌趋化因子CCL2，宾夕法尼亚大学CarlJune研究小组设计了同时表达CCL2受体CCR2的抗MesothelinCAR-T细胞，从而通过CCL2/CCR2的作用趋化CAR-T细胞至肿瘤组织高效发挥杀伤作用。斯隆-凯特琳癌症中心则恶性胸膜瘤中比较了胸腔内输注和系统输注CART细胞的效果，发现胸腔内输注方式能使细胞持续性强，肿瘤内部积聚多，发挥更好的抗肿瘤作用。斯隆-凯特琳癌症中心即将就该种输注方式的安全性进一步开展临床研究。CAR-T细胞的一大优点是它们是活性药物，一旦输入，生理机制会调控T细胞的平衡、记忆形成和抗原驱动的扩增。然而，这种治疗尚未完善，T细胞会脱靶而攻击其他的组织，或扩增量过高，超出治疗所需。鉴于CAR-T细胞已被纳入标准治疗范围，设计病人或药物可控的启动或关闭机制来调控CAR-T细胞的存在是非常有用的。由于技术原因，关闭机制更易应用于T细胞。作为其中之一，iCas9系统正在临床研究当中。细胞在表达iCas9时，使用小分子化合物可诱导iCas9前体分子形成二聚体，激活凋亡途径，从而实现清除细胞的目的。在移植物抗宿主病中，小分子AP1903已被用于诱导iCas9二聚体和清除T细胞，表明了这种方法的可行性(ClinCancerRes.2016Apr15；22(8):1875-84.)。另外，还可利用临床上已经使用的清除性抗体，使CAR-T细胞同时表达这些抗体针对的蛋白，如tEGFR，在治疗相关的毒性反应产生或是治疗已经完成后，通过给予抗体药物清除相应的CAR-T细胞(SciTranslMed2015；7：275ra22.)。本专利技术对构建的靶向Mesothelin的四代CAR，本专利技术采用的是人源化Mesothelin本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种多核苷酸序列，所述多核苷酸序列选自：(1)含有依次连接的抗间皮素单链抗体的编码序列、人CD8α铰链区的编码序列、人CD8α跨膜区的编码序列、人CD28胞内区的编码序列、人41BB胞内区的编码序列、人CD3ζ胞内区的编码序列、任选的EGFR的含胞外结构域III和胞外结构域IV的片段的编码序列；和(2)(1)所述多核苷酸序列的互补序列。

【技术特征摘要】
1.一种多核苷酸序列，所述多核苷酸序列选自：(1)含有依次连接的抗间皮素单链抗体的编码序列、人CD8α铰链区的编码序列、人CD8α跨膜区的编码序列、人CD28胞内区的编码序列、人41BB胞内区的编码序列、人CD3ζ胞内区的编码序列、任选的EGFR的含胞外结构域III和胞外结构域IV的片段的编码序列；和(2)(1)所述多核苷酸序列的互补序列。2.如权利要求1所述的多核苷酸序列，其特征在于，所述多核苷酸序列在所述抗间皮素单链抗体的编码序列前还含有信号肽的编码序列，优选地，所述信号肽的多核苷酸序列如SEQIDNO:1第1-63位多核苷酸所示；和/或所述抗间皮素单链抗体的多核苷酸序列如SEQIDNO:1第64-837位多核苷酸所示；和/或所述人CD8α铰链区和CD8跨膜区的多核苷酸序列如SEQIDNO:1第838-1044位多核苷酸所示；和/或所述人CD28胞内区的多核苷酸序列如SEQIDNO:1第1045-1167位多核苷酸所示；和/或所述人41BB胞内区的多核苷酸序列如SEQIDNO:1第1168-1311位多核苷酸所示；和/或所述人CD3ζ胞内区的多核苷酸序列如SEQIDNO:1第1312-1644位多核苷酸所示；和/或所述EGFR的片段含有EGFR的胞外结构域III、胞外结构域IV以及跨膜区，或由EGFR的胞外结构域III、胞外结构域IV以及跨膜区组成；优选地，所述片段含有人EGFR的第310-646位多核苷酸序列，或由人EGFR的第310-646位多核苷酸序列组成；更优选地，所述片段的多核苷酸序列如SEQIDNO:1第1803-2796位多核苷酸所示。3.一种融合蛋白，所述融合蛋白选自：(1)含有依次连接的抗间皮素单链抗体、人CD8α铰链区、人CD8跨膜区、人CD28胞内区、人41BB胞内区和人CD3ζ胞内区的融合蛋白、任选的EGFR的含胞外结构域III和胞外结构域IV的片段的编码序列；和(2)在(1)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且保留活化T细胞活性的由(1)衍生的融合蛋白；优选地，所述抗间皮素单克隆抗体P4。4.如权利要求3所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白具有以下一个或多个特征：所述融合蛋白在所述抗间皮素单链抗体的N端还含有信号肽，优选地，所述信号肽的氨基酸序列如SEQIDNO:2第1-21位氨基酸所示；所述抗间皮素单...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘雅容，金涛，
申请(专利权)人：上海恒润达生生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31