本发明专利技术公开了一种高活性重组人凝血因子IX融合蛋白及其制备方法。包括启动子，人凝血因子IX蛋白基因，人免疫球蛋白IgG1的Fc段基因和终止子。本发明专利技术利用载体将人FIX‑Fc融合蛋白基因表达盒转入哺乳动物基因组中获得转基因动物，从转基因动物乳汁中获得人FIX‑Fc融合表达蛋白。依据本发明专利技术的方法，在动物乳汁中表达的人FIX活性可达6IU/ml，平均比活可高达3000IU/mg，比天然FIX高约12倍，可用于人凝血因子IX的生产。
A highly active recombinant human coagulation factor IX fusion protein and its preparation method
The invention discloses a highly active recombinant human coagulation factor IX fusion protein and a preparation method thereof. Including promoter, human coagulation factor IX protein gene, Fc segment gene and terminator of human immunoglobulin IgG1. The present invention utilizes a vector to transfer the gene expression box of human FIX Fc fusion protein into mammalian genome to obtain transgenic animals and human FIX Fc fusion expression protein from the milk of transgenic animals. According to the method of the invention, the activity of human FIX expressed in animal milk can reach 6IU/ml, the average specific activity can reach 3000IU/mg, which is about 12 times higher than that of natural FIX, and can be used for the production of human coagulation factor IX.
【技术实现步骤摘要】
一种高活性重组人凝血因子IX融合蛋白及其制备方法
本专利技术属于转基因
，具体涉及一种高活性重组人凝血因子IX融合蛋白及其制备方法。
技术介绍
血友病B是一种X染色体连锁的隐性遗传性出血性疾病，男性新生儿中的发病率约为1/25000，因患者凝血因子IX(FIX，FactorIX)基因突变导致体内FIX蛋白合成缺乏所致，患者易发生自发性出血，重症患者常因关节出血、脑出血等导致残疾，影响生活质量和寿命。目前，血友病B患者主要依靠静脉输注补充外源凝血因子IX来进行治疗，这类产品包括血液来源和重组来源的凝血因子IX制品。人免疫球蛋白IgG的Fc片段可通过与FcRn结合介导与其融合蛋白的再循环过程，从而延长目标蛋白的半衰期，该方法在药物的生产中已经得到了广泛应用。百健公司的Alprolix是首个上市的FIX-Fc融合蛋白药物，临床研究显示其与野生型的FIX相比具有等同的活性，但半衰期显著增加2-3倍，有效缩短了患者的用药间隔(NCT01425723)。凝血因子IX存在一系列功能获得性(gain-of-functionmutation)突变可使凝血活性获得不同程度的增加。例如，2009年在一个意大利家族中发现的突变型FIX蛋白，其384位由精氨酸变为亮氨酸(R384L，也被称为FIXPadua)，该突变导致FIX凝血活性增加5-10倍。目前该突变型已被用于基因治疗研究，临床试验取得了良好的效果(PCT/EP2009/061935)。另有一篇1999年发表于theJournalofBiologicalChemistry的文章中描述了FIX的另一个功能获得性突变(R384A)，体外研究显示该突变相比野生型活性增加2-3倍[JinliChang,JianpingJin,PeteLollar,et.al.ChangingResidue338inHumanFactorIXfromArgininetoAlanineCausesanIncreaseinCatalyticActivity[J].TheJournalofBiologicalChemistry,1998,273(20):12089–12094]；转基因动物乳腺表达的该突变体蛋白的体内外凝血活性可提高2.5-3倍[YANJ-B,WANGS,HUANGW-Y,etal.TransgenicMiceCanExpressMutantHumanCoagulationFactorIXwithHigherLevelofClottingActivity[J].BiochemicalGenetics,2006,44(7-8):347-358.]。功能获得性突变体在血友病B基因治疗和重组蛋白药物研发的应用可提高凝血因子IX的活性表达水平，具有重要的应用价值。目前，重组人凝血因子通常产量较低、半衰期短、价格昂贵。而与重组细胞生产凝血因子IX相比，动物生物反应器的生产成本相对低廉，是廉价大量生产FIX的一个潜力方向。专利技术人利用的牛乳腺生物反应器及ProGenes公司的猪乳腺生物反应器均可人FIX的表达，临床前体内和体外活性试验证实所产生的FIX具有高效凝血活性。但在已公开的任何报道中还未有报道利用乳腺生物反应器表达FIX融合蛋白的先例，也未知乳腺生物反应器表达FIX融合蛋白是否仍具有FIX活性并能维持高表达水平。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种高活性重组人凝血因子IX融合蛋白及其制备方法。一种高活性重组人凝血因子IX融合蛋白基因，其特征在于，包括启动子，人凝血因子IX蛋白基因，人免疫球蛋白IgG1的Fc段基因和终止子。所述的启动子是本领域常规，只要能够在哺乳动物细胞中启动下游基因的表达即可，较佳的是在哺乳动物乳腺组织中启动表达效率高的启动子，较佳的是β-酪蛋白基因启动子，更佳的是山羊β-酪蛋白基因启动子。所述人凝血因子IX为高凝血活性突变体，其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，位置1960-1961位的核苷酸为GC而非CG。所述的凝血因子IX为高活性突变体，其氨基酸序列如SEQIDNO：2所示，位置384的氨基酸为A而非R。所述人免疫球蛋白IgG1的Fc段核酸序列如SEQIDNO：3所示，氨基酸序列如SEQIDNO：4所示。所述人凝血因子IX基因与人免疫球蛋白IgG1的Fc段基因之间包括接头序列。所述接头是由氨基酸序列(GGGGS)n表示的肽，其中n是1-20的整数，所述的接头还包含一段柔性多肽EFAGAAAV的肽。一种利用转基因动物乳腺生物反应器生产高活性重组人凝血因子IX融合蛋白的方法，将含有所述高活性重组人凝血因子IX融合蛋白基因的载体经原核显微注射整合入受精卵使转基因哺乳动物乳腺表达并分泌所述的外源重组凝血因子IX融合蛋白；所述哺乳动物为小鼠，牛或羊。一种高活性凝血因子IX的突变蛋白的乳腺特异表达载体的制备方法，包括如下步骤：(1)将凝血因子IX(R384A)突变的人凝血因子IX基因与人IgG1的Fc片段cDNA通过接头序列连接构建入载体中，得到重组质粒；(2)将上述重组载体显微注射导入小鼠受精卵，制备hFIX-Fc转基因小鼠；(3)PCR法鉴定阳性小鼠，取阳性小鼠交配繁育，获得阳性母鼠乳汁；(4)检测小鼠乳汁中的hFIX-Fc融合蛋白表达情况。所述重组载体为真核表达载体pcDNA3.1(-)。本专利技术的有益效果：本专利技术首次在乳腺生物反应器表达系统中实现FIX融合蛋白的高效表达，证实乳腺生物反应器可正确表达FIX-Fc融合蛋白，且相比于非融合蛋白，FIX-Fc融合蛋白具有更高的比活性。附图说明图1为融合PCR构建人凝血因子IX-Fc融合表达基因示意图。图2为本专利技术载体构建示意图。图3为HepG2细胞瞬时转染相应质粒hFIX-Fc融合蛋白ELISA检测结果。图4为转基因小鼠乳汁中hFIX-Fc融合蛋白ELISA检测结果。图5为转基因小鼠乳汁中hFIX-Fc融合蛋白活性表达结果。图6为转基因小鼠乳汁中hFIX-Fc融合蛋白比活性结果。具体实施方式下面结合实例具体阐明本专利技术，在此之前请理解，除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本专利技术所属领域普通技术人员所通常理解的相同的含义。尽管与本文描述的那些类似或等同的方法和材料可用于实施或测试本专利技术，但下面描述了合适的方法和材料。冲突时，以包括定义在内的本专利说明为准。此外应理解，材料、方法和实例仅是示例说明性的，本领域技术人员可以对本专利技术作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。实施例1一、片段合成1)人IgG1FccDNA片段的扩增用上游引物Fc-F：5’-GAGCCCAAATCTTGTGACAAAACT-3’；下游引物Fc-R：5’-TTTACCCGGAGACAGGGAGAGGCT-3’，以人外周血细胞cDNA为模板，进行PCR扩增。反应体系如下：总共做4个反应管，反应条件为94℃5min；(94℃45sec,56℃45sec,72℃3min)×30个循环；72℃10min。扩出约0.7kb的hIgG1FccDNA片段，将反应液混合后，取2μL送至上海美吉生物技术公司进行测序，余下产物产物经琼脂糖电泳，切胶并用试剂盒回收0.7kb的hIgG1FcCDNA片段。然后将测序所得序列与G本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种高活性重组人凝血因子IX融合蛋白基因，其特征在于，包括启动子，人凝血因子IX蛋白基因，人免疫球蛋白IgG1的Fc段基因和终止子。
【技术特征摘要】
1.一种高活性重组人凝血因子IX融合蛋白基因，其特征在于，包括启动子，人凝血因子IX蛋白基因，人免疫球蛋白IgG1的Fc段基因和终止子。2.根据权利要求1所述高活性重组人凝血因子IX融合蛋白基因，其特征在于，所述启动子是山羊β酪蛋白基因启动子。3.根据权利要求1所述高活性重组人凝血因子IX融合蛋白基因，其特征在于，所述人凝血因子IX为高凝血活性突变体，其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，位置1960-1961位的核苷酸为GC而非CG。4.根据权利要求1所述高活性重组人凝血因子IX融合蛋白基因，其特征在于，所述的凝血因子IX为高活性突变体，其氨基酸序列如SEQIDNO：2所示，位置384的氨基酸为A而非R。5.根据权利要求1所述高活性重组人凝血因子IX融合蛋白基因，其特征在于，所述人免疫球蛋白IgG1的Fc段核酸序列如SEQIDNO：3所示，氨基酸序列如SEQIDNO：4所示。6.根据权利要求1所述高活性重组人凝血因子IX融合蛋白基因，其特征在于，所述人凝血因子IX基因与人免疫球蛋白IgG1的Fc段基因之间包括接头序列。7.根据权利要求6所述高活性重组人凝血因子IX融...
【专利技术属性】
技术研发人员：曾凡一，黄淑帧，曾溢滔，严红，
申请(专利权)人：上海市儿童医院，上海滔华生物医药科技合伙企业有限合伙，
类型：发明
国别省市：上海,31
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