土沉香、云南沉香、马来沉香的SNP分子标记及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种用于鉴定土沉香、云南沉香、马来沉香的SNP分子标记及其应用。本发明专利技术基于SNP分子标记建立起了快速鉴定土沉香、云南沉香、马来沉香的体系，从而实现了快速、准确检测土沉香、云南沉香、马来沉香的目的，对于口岸物种检验工作等具有重大的意义。

SNP Molecular Markers and Their Applications of Agaricus sinensis, Agaricus yunnanensis and Agaricus MALAYI

The invention discloses a SNP molecular marker used for identifying earthy aloes, Yunnan aloes and Malay aloes and its application. Based on SNP molecular markers, the system for rapid identification of Alpinia sinensis, Alpinia yunnanensis and Alpinia malayi has been established, thus realizing the purpose of rapid and accurate detection of Alpinia sinensis, Alpinia yunnanensis and Alpinia malayi, which is of great significance for species inspection at ports.

【技术实现步骤摘要】
土沉香、云南沉香、马来沉香的SNP分子标记及其应用
本专利技术涉及木材材种鉴定的分子生物学检测领域，具体地说，涉及用于鉴定土沉香、云南沉香、马来沉香的SNP分子标记及其应用。
技术介绍
沉香，又名“沉水香”，“水沉香”，古语写作“沈香”(沈，同沉)。古来常说的“沉檀龙麝”之“沉”，就是指沉香。沉香香品高雅，而且十分难得，自古以来即被列为众香之首。与檀香不同，沉香并不是一种木材，而是一类特殊的香树“结”出的，混合了油脂(树脂)成分和木质成分的固态凝聚物。而这类香树的木材本身并无特殊的香味，而且木质较为松软。据现在的研究，瑞香科沉香属的几种树木，如马来沉香树、莞香树、印度沉香树等都可以形成沉香。沉香的价格之贵，素有“木中钻石”之称。据知名文化学者扬之水介绍，沉香是中国、日本、印度及其他东南亚国家的传统药材和名贵天然香料，在传统中医学、藏医学和印度传统医学中已有几千年的应用历史，其药用、精油、香料等方面市场需求量巨大。“粗略统计，目前全世界沉香交易额达200亿元以上。据史料记载，在宋代，上等品是一两沉香一两金；到了明代，就变成了一寸沉香一寸金。”形态学鉴定是沉香鉴定中常采用的方法，但形状特征易受生境、气候、生理状况等的影响而常常导致主观辨别上的偏差，仅靠形态差异难以准确鉴定。近年来，利用分子生物学技术进行物种鉴定已经在一些珍惜物种及检验检疫方面得到了应用，如何利用分子生物学技术建立高效、快速、灵敏且准确度高的鉴定方法将是沉香鉴定领域的关键技术之一。
技术实现思路
本专利技术提供了一种用于鉴定土沉香、云南沉香、马来沉香的SNP分子标记，所述SNP分子标记位于SEQIDNO.1、SEQIDNO.2或SEQIDNO.3所示序列的第190-191碱基，若第190-191位的碱基为GT则鉴定为土沉香，若第190-191碱基为TT则鉴定为云南沉香，若第190-191碱基为CC则鉴定为马来沉香。所述SNP分子标记在土沉香、云南沉香、马来沉香鉴定中的应用。所述应用进一步包括从土沉香、云南沉香、马来沉香混合树种中分别鉴定出土沉香、云南沉香、马来沉香。本专利技术提供了一种用于鉴定土沉香、云南沉香、马来沉香的核苷酸序列，所述核苷酸序列包括SEQIDNO.1、SEQIDNO.2或SEQIDNO.3，或者SEQIDNO.1、SEQIDNO.2或SEQIDNO.3所对应的cDNA或mRNA，所述核苷酸序列的第190-191位的碱基为GT则鉴定为土沉香，若第190-191碱基为TT则鉴定为云南沉香，若第190-191碱基为CC则鉴定为马来沉香。本专利技术提供了一种鉴定土沉香、云南沉香、马来沉香的试剂盒，包括用于特异性检测SEQIDNO.1、SEQIDNO.2或SEQIDNO.3序列第190-191位的碱基为GT、TT或CC的一种或多种引物，或引物和探针的组合。进一步的，所述的试剂盒内的引物和/或探针选自：用于测序检测的特异性扩增引物和测序引物，引物序列分别为：上游引物F1：5'-CGTAACAAGGTTTTCGTAGGTGAAC-3'下游引物R1：5'-GCTACGTTCTTCATCGAT-3'测序引物：5'-CGTAACAAGGTTTTCGTAGGTGAAC-3'；或者，用于HRM-PCR方法鉴定的扩增特异性扩展引物和探针，引物和探针序列分别为：上游引物F2：5’-AAGGAACTTGATCACATAATATGTT-3’下游引物R2：5’-TCATTTTAGATTCGTTTCAACGC-3’；或者，用于ARMS-PCR扩增的特异性引物，引物序列为：上游引物FP：5’-CTTGTGGCCGTCATAACCAAACC-3’土沉香下游引物TR：5’-CGTTTCAACGCTTGATCTCA-3’云南沉香下游引物YR：5’-CGTTTCAACGCTTGATCTAA-3’马来沉香下游引物MR：5’-CGTTTCAACGCTTGATCTGG-3’所述试剂盒还包括阳性质控品和阴性质控品。本专利技术提供了一种制备鉴定土沉香、云南沉香、马来沉香试剂盒的方法，包括制备检测反应试剂的步骤，所述反应试剂包含用于特异性检测SEQIDNO.1、SEQIDNO.2或SEQIDNO.3序列第190-191位的碱基为GT、TT或CC的一种或多种引物，或引物和探针的组合。本专利技术提供了一种用于鉴定土沉香、云南沉香、马来沉香的寡核苷酸，所述寡核苷酸用于特异性检测SEQIDNO.1、SEQIDNO.2或SEQIDNO.3序列第190-191位的碱基为GT、TT或CC的一种或多种引物，或引物和探针组合，所述寡核苷酸选自用于测序的特异性扩增引物序列和测序引物序列，分别为上游引物F1：5'-CGTAACAAGGTTTTCGTAGGTGAAC-3'下游引物R1：5'-GCTACGTTCTTCATCGAT-3'测序引物：5'-CGTAACAAGGTTTTCGTAGGTGAAC-3'；或者，用于HRM-PCR方法鉴定的扩增特异性上游引物F2序列、下游引物R2序列和探针P2序列分别为：上游引物F2：5’-AAGGAACTTGATCACATAATATGTT-3’下游引物R2：5’-TCATTTTAGATTCGTTTCAACGC-3’；探针P2：或者用于ARMS-PCR扩增的特异性上游引物序列和下游引物序列分别为：上游引物FP：5’-CTTGTGGCCGTCATAACCAAACC-3’土沉香下游引物TR：5’-CGTTTCAACGCTTGATCTCA-3’云南沉香下游引物YR：5’-CGTTTCAACGCTTGATCTAA-3’马来沉香下游引物MR：5’-CGTTTCAACGCTTGATCTGG-3’本专利技术提供了一种鉴定土沉香、云南沉香、马来沉香的方法，包括以下步骤：(1)提取待测植物的基因组DNA；(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，进行PCR扩增，以检测检测SEQIDNO.1、SEQIDNO.2或SEQIDNO.3序列第190-191位碱基情况；(3)经检测，若第190-191位的碱基为GT则鉴定为土沉香，若第190-191碱基为TT则鉴定为云南沉香，若第190-191碱基为CC则鉴定为马来沉香。本专利技术与现有技术相比具有以下优点和效果：本专利技术在对沉香，尤其是对土沉香、云南沉香、马来沉香三种沉香大量基因信息进行分析比较的基础上，并根据序列位点多态性，设计土沉香、云南沉香、马来沉香的特异引物和探针，建立了土沉香、云南沉香、马来沉香特异性的荧光定量PCR鉴定检测方法。本专利技术并不需要木材有完整的形态结构，只需从木料上取极少量木材样本，即可满足检测要求，操作简单。并且通过SNP分子标记做出判断，鉴定过程客观、准确。克服了传统鉴定方法主要依赖于形态鉴定方法，并必须建立在有完整易辨识的形态结构的基础上的技术局限性。本专利技术采用ARMS技术利用特异引物对突变靶序列进行高精准PCR扩增放大，与此同时，利用探针对扩增产物进行检测，在实时荧光定量PCR平台上实现对土沉香、云南沉香、马来沉香检测的高特异性和高灵敏度。附图说明图1HRM-PCR方法鉴定结果。图2测序法鉴定土沉香的结果。图3测序法鉴定云南沉香的结果。图4测序法鉴定马来沉香的结果。图5土沉香电泳验证结果：1泳道表示的是土沉香质控品PCR结果；2泳道表示的是本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于鉴定土沉香、云南沉香、马来沉香的SNP分子标记，其特征在于，所述SNP分子标记位于SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示序列的第190‑191碱基，若第190‑191位的碱基为GT则鉴定为土沉香，若第190‑191碱基为TT则鉴定为云南沉香，若第190‑191碱基为CC则鉴定为马来沉香。

【技术特征摘要】
2017.09.11 CN 20171081411241.用于鉴定土沉香、云南沉香、马来沉香的SNP分子标记，其特征在于，所述SNP分子标记位于SEQIDNO.1、SEQIDNO.2或SEQIDNO.3所示序列的第190-191碱基，若第190-191位的碱基为GT则鉴定为土沉香，若第190-191碱基为TT则鉴定为云南沉香，若第190-191碱基为CC则鉴定为马来沉香。2.权利要求1所述SNP分子标记在土沉香、云南沉香、马来沉香鉴定中的应用。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，从土沉香、云南沉香、马来沉香混合树种中分别鉴定出土沉香、云南沉香、马来沉香。4.用于鉴定土沉香、云南沉香、马来沉香的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列包括SEQIDNO.1、SEQIDNO.2或SEQIDNO.3，或者SEQIDNO.1、SEQIDNO.2或SEQIDNO.3所对应的cDNA或mRNA，所述核苷酸序列的第190-191位的碱基为GT则鉴定为土沉香，若第190-191碱基为TT则鉴定为云南沉香，若第190-191碱基为CC则鉴定为马来沉香。5.一种鉴定土沉香、云南沉香、马来沉香的试剂盒，其特征在于，包括用于特异性检测SEQIDNO.1、SEQIDNO.2或SEQIDNO.3序列第190-191位的碱基为GT、TT或CC的一种或多种引物，或引物和探针的组合。6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述引物和/或探针选自：用于测序检测的特异性扩增引物和测序引物，引物序列分别为：上游引物F1：5'-CGTAACAAGGTTTTCGTAGGTGAAC-3'下游引物R1：5'-GCTACGTTCTTCATCGAT-3'测序引物：5'-CGTAACAAGGTTTTCGTAGGTGAAC-3'；或者，用于HRM-PCR方法鉴定的扩增特异性扩展引物，引物序列为：上游引物F2：5’-AAGGAACTTGATCACATAATATGTT-3’下游引物R2：5’-TCATTTTAGATTCGTTTCAACGC-3’；或者，用于ARMS-PCR扩增的特异性引物，引物序列为：上游引物FP：5’-CTTGTGGCCGTCATAACCAAACC-3’土沉香下游引物TR：5’-CGTTTCAACGCTTGATCTCA-3’云南沉香下游引物YR...

【专利技术属性】
技术研发人员：林源吉，丁佳女，郑宜文，
申请(专利权)人：杭州百迈生物股份有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33