木薯U6启动子基因及应用制造技术

本发明专利技术公开了3个木薯U6启动子基因及应用，该3个启动子序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示，通过GUS染色瞬时表达验证，能高效的在木薯上表达。在转基因技术领域，这些启动子不仅适用于木薯，除用于启动功能基因表达外，在构建RNAi表达载体时可用于启动发夹结构的表达，在CRISPR/Cas9系统中可用于启动sgRNA引导序列的表达等。

Cassava U6 Promoter Gene and Its Application

The invention discloses three cassava U6 promoter genes and their applications. The three promoter sequences, such as SEQ ID NO.1, SEQ ID NO.2 and SEQ ID NO.3, can be efficiently expressed on cassava by GUS staining instantaneous expression verification. In the field of genetically modified technology, these promoters are not only suitable for cassava, but also can be used to start the expression of hairpin structure in the construction of RNAi expression vector and sgRNA guiding sequence in CRISPR/Cas9 system.

【技术实现步骤摘要】
木薯U6启动子基因及应用
本专利技术属生物
，特别是植物转基因
，具体涉及木薯U6启动子的克隆和应用。
技术介绍
木薯(ManihotesculentaCrantz)属大戟科(Euphorbiaceae)木薯属(ManihotP.Mill.)植物，是世界三大薯类(木薯、甘薯和木薯)作物之一，同时也是热带地区继水稻、玉米、高粱之后的第四大粮食作物，是热带和亚热带地区重要的热能来源，为世界上近6亿人提供食物。木薯广泛分布于全球南、北纬30°之间的热带及部分亚热带地区。我国木薯主产区有海南、广东、广西、福建、云南，在四川、贵州、湖南、江西、浙江等地也有种植。木薯对光、热和水资源的利用非常高，单位面积生物能产量几乎高于其它栽培作物，具有抗旱、耐贫瘠、适应性广以及储藏根(块根)淀粉含量高(占干重的85％)等独特而优良的生物学特性。木薯淀粉是食品加工、工业变性淀粉、饲料和生物质产品(燃料乙醇)的重要原料。木薯已有几千年的栽培历史，因植株基因型高度杂合、基因冗余、花粉育性低、有性子代严重分离等自身特征和种质资源的局限性，其常规育种困难且进展较慢。近年来，通过转基因途径改良木薯品种获得阶段性进展，例如在降低氰化物、提高块根淀粉含量、改良直(支)淀粉比例以及抗病、耐寒、抗旱转基因育种都取得良好进展。尽管如此，木薯转基因育种仍然存在不少亟待解决的问题。其中，挖掘适合木薯本身的特异启动子。目前广泛用于木薯的启动子是CaMV35s，CaMV35s并不适宜驱动块根基因的表达。虽然已有马铃薯块茎patatin蛋白特意启动子、Pt214等相继用于木薯转化，但相较于水稻、小麦等粮食作物，木薯自身的启动子资源相对匮乏。U6启动子是二型启动子，与真核生物RNA聚合酶III结合后，负责转录U6RNA，这类启动子的特点是几乎所有启动子元件(除了+1位的转录起点)都位于转录起始位点的上游，也即它对转录起点后的序列无特殊选择或要求，能保证转录序列的结构特征。U6启动子+1位是鸟苷酸。RNA聚合酶III启动子识别的终止信号是连续4-5个胸苷酸，转录产物末端一般有4个尿苷酸。几乎所有的真核生物都具有U6启动子，U6启动子在真核生物体内一般发现是启动小片段，不带PolyA尾的序列，由RNA聚合酶III聚合U6启动子转录产生shRNA，经剪切后产生成熟siRNA，产生干扰效果；shRNA的表达量取决于启动子的强弱，与同类的RNA聚合酶III的启动子H1相比，U6启动子启动能力更强，表达时间也长。目前，在转基因
，U6启动子多用在构建RNAi表达载体上，用于启动干扰发夹结构的表达；此外，随着基因编辑技术的兴起，U6启动子也被开始广泛用于CRISPR系统中sgRNA引导序列的启动表达，以保证引导序列的结构特征。U6启动子具有种属特异性，在转基因技术中，使用转化物种本身或接近物种的U6启动子能取得更高的的启动效率。前人研究表明，人U6启动子有几个明显的特点：1、具有TATAbox，位于-30～-25bp，被PolIII转录；2、在转录起点上游-66～-47bp处存在PSE(proximalsequenceelement)，该元件是snRNA激活因子蛋白复合物的结合位点；3、在-244～-214存在DSE(distalsequenceelement)；4、启动子下游存在5'-TTTT-3'序列为PolIII提供转录终止信号；5、PSE和DSE之间的距离变化可显著影响转录效率；6、+1位的G对转录效率影响较大。根据这些特点，在使用U6启动子构建RNAi表达载体时，U6启动子的长度最好在300bp左右，尽量不改变PSE和DSE的间距，同时保留TATAbox和+1位的G，在下游应有5'-TTTTT-3'序列作为终止信号。另外可以根据需要在启动子上游或终止信号下游设计测序引物序列、酶切位点等等。木薯转基因研究对块根、块茎类植物生物技术的研究越来越重要，木薯U6启动子的克隆和应用，必将推进这些植物相关
的研究，具有重要的现实意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供3个克隆的木薯U6启动子，并将这3个启动子与GUS基因融合表达转化木薯胚性愈伤，通过瞬时表达验证了3个启动子能够在木薯上高效表达，为木薯及相近植物的转化研究提供了高效的启动子序列。为了实现上述目的，本专利技术的技术方案为：提供木薯U6启动子基因，包括3个木薯U6启动子基因，分别具有序列表中SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3所示的核苷酸序列。启动子序列SEQIDNO:1、SEQIDNO:2均来自于木薯Chr_04染色体，启动子序列SEQIDNO.3来自于Chr_12染色体。本专利技术的另一目的在于提供木薯U6启动子基因在转基因
中的应用。该3个启动子还包括含有如SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3所示基因序列的其它序列。本专利技术利用snRNA序列在真核生物体内非常保守的序列特征，用拟南芥AtU6启动子的snRNA序列与木薯的基因组序列进行比对，通过比对序列结果设计多对引物，PCR克隆出木薯的3个U6启动子，并构建与GUS基因融合表达载体转化木薯胚性愈伤，GUS染色瞬时表达验证表明，克隆出的3个木薯U6启动子在木薯上具有很强的启动效率，能在木薯上很好的启动GUS基因的表达。附图说明图1：从木薯DNA上克隆出3个U6启动子序列；图2：从木薯N、O、P序列上PCR出构建GUS融合表达载体具有粘性末端的3个U6启动子序列；图3：用于转化的pZmUbi-GUS(ZmUbis-HPH)质粒载体图；图4：是用于转化的pMaU6N-GUS(MaU6N-HPH)质粒载体图；图5：是用于转化的pMaU6O-GUS(MaU6O-HPH)质粒载体图；图6：是用于转化的pMaU6P-GUS(MaU6P-HPH)质粒载体图；图7：木薯胚性愈伤GUS基因瞬时表达情况。Ubi是对照载体pZmUbi-GUS(ZmUbis-HPH)载体，N是pMaU6N-GUS(MaU6N-HPH)载体，O是pMaU6O-GUS(MaU6O-HPH)载体，P是pMaU6P-GUS(MaU6P-HPH)载体CK是空白对照；图8：各处理均值比较图(5％显著水平)。具体实施方式木薯U6启动子的克隆和功能验证方法，其具体步骤如下：1、利用U6启动子snRNA序列的保守性，在https://phytozome.jgi.doe.gov网站上，利用拟南芥AtU6启动子的snRNA序列(gtcccttcggggacatccgataaaattggaacgatacagagaagattagcatggcccctgcgcaaggatgacacgcataaatcgagaaatggtccaaatttt)与木薯的基因组(Manihotesculentav6.1)序列进行比对(BLAST)。检查比对结果，从中挑选出序列同源性大于95％的位置(Chr_04、Chr_11、Chr_12、Chr_13)，下载这些位置的序列信息，并在http://seqtool.sdsc.edu/CGI/BW.cgi#！网站上对挑选出的序列进行BOXSHADE(盒式)序列分析比对，找到这些启动序列的USE位置和TATA框位置。2、木薯U6启动子的PC本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.木薯U6启动子基因，其特征在于：包括3个木薯U6启动子基因，分别具有序列表中SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
1.木薯U6启动子基因，其特征在于：包括3个木薯U6启动子基因，分别具有序列表中SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3所示的核苷酸序列。2.如权利要求1所述的木薯U6启动子基因，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵辉，孔华，贺萍萍，郭安平，张雨良，张丽丽，郭静远，屈静，
申请(专利权)人：中国热带农业科学院热带生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：海南,46