热稳定聚合酶抑制剂组合物和方法技术

本公开内容涉及用于温度依赖性可逆抑制热稳定聚合酶活性的适体，以改进涉及热启动多核苷酸合成的各种反应和测定的灵敏度和特异性。还提供了适体的使用方法和相关的组合物和试剂盒。

Compositions and methods of thermally stabilized polymerase inhibitors

The present disclosure relates to aptamers for temperature-dependent reversible inhibition of thermostable polymerase activity to improve the sensitivity and specificity of various reactions and measurements involving thermo-initiated polynucleotide synthesis. The use method of the suitable body and the related compositions and kits are also provided.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】热稳定聚合酶抑制剂组合物和方法相关申请的交叉引用本申请要求2016年6月7日提交的USSN62/347,004的权益和优先权，其全部内容通过引用并入本文，用于所有目的。序列表的交叉引用本申请包括序列表，该序列表已经以ASCII格式电子提交，并且其全部内容通过引用并入本文。2017年6月6日创建的此ASCII副本名为CPHDP012WO_2017-06-06_SeqList.txt，大小为20795字节。
本公开内容通常涉及热稳定聚合酶活性的核酸抑制剂、包含所述抑制剂的组合物及其使用方法。所述核酸抑制剂可以适应二级结构以可逆地抑制热稳定聚合酶，其中抑制活性是温度依赖性的。所述抑制剂可用于包括通过热稳定聚合酶的核酸合成的方法和测定，其中方法和测定受益于利用热启动方法。
技术介绍
核酸靶序列的体外合成(许多研究测定和诊断产物的基础)通常部分依赖于使用热稳定DNA聚合酶和至少一种寡核苷酸引物，所述寡核苷酸引物被设计来特异性结合在怀疑含有靶标的样品中的靶核酸底物。虽然设计使用聚合酶和引物的测定以产生特定序列，但众所周知，如果测定需要在较低或环境温度下的一段时间，则靶特异性引物可与非靶序列杂交或可形成引物二聚体，导致错误启动(mispriming)并随后产生非特异性产物。这些产品是不希望的，因为它们可以掩盖目的产物以及过早耗尽必要试剂的反应混合物。用于减少错误启动影响的主要手段是在更可能发生这种错误启动的较低温度下可逆地抑制热稳定聚合酶活性。在将聚合酶反应混合物的温度升高至接近热稳定聚合酶的最佳反应温度的温度时，除去抑制活性并且热稳定聚合酶延伸与底物核酸分子结合的引物。这种可逆地抑制嗜热DNA聚合酶以防止引物在较低温度下延伸的方法被称为“热启动(hot-start)”。热启动可以通过各种物理、化学或生物化学方法完成。在物理热启动中，DNA聚合酶或DNA聚合酶活性必需的一种或多种反应组分不允许与样品DNA接触，直到反应所需的所有组分都处于高温(Horton，R.M.等人，Biotechniques，16；42-43，1994)。化学热启动是指涉及使用化学上可逆地失活的DNA聚合酶的方法，使得聚合酶在环境温度下被抑制并且在更高温度下最具活性(美国专利号5,773,258和6,183,998)。实现热启动的另一种方法是将DNA聚合酶与抗DNA聚合酶抗体结合，然后将其加入试剂中。抗体在环境温度下抑制聚合酶活性，但在高聚合酶反应温度下，抗体变性并与聚合酶解离，从而激活聚合酶(Sharkey等人，Bio/Technology，12：506-509(1994)；Kellogg等人，Biotechniques，16：1134-1137(1994))。在环境温度下抑制嗜热DNA聚合酶的另一种方法涉及使用结合至DNA聚合酶并抑制DNA聚合酶的核酸适体(aptamer)(美国专利号6,183,967)。适体是通过除经典Watson-Crick碱基配对之外的相互作用对分子具有特异性结合亲和力的核酸分子。已经选择并设计了各种适体以显示对热稳定聚合酶的特异性和亲和力，并且已经显示它们能够可逆地抑制聚合酶。与热稳定聚合酶的其他可逆抑制剂一样，设计适体以在环境温度下结合和抑制热稳定聚合酶。随后温度的升高导致适体与热稳定聚合酶解离，以允许在高反应温度下的引物延伸和/或核酸扩增。当设计及选择用于需要热稳定聚合酶活性的反应的抑制性适体时，重要的是产生在合适的温度范围(例如最佳聚合酶活性的温度范围)内结合并抑制聚合酶的适体，但是在选定的引物与靶核酸底物杂交的温度下，适体也在允许最佳热稳定聚合酶活性的温度下与聚合酶解离。本文描述了适体，其可以形成二级结构，并且可以在依赖于热稳定聚合酶活性的各种测定中减少非特异性聚合酶产物的产生，但是可以与聚合酶解离以促进靶产物的产生和检测。专利技术概述在一个方面，提供了一种适体，其中适体在5′至3′方向包含：第一核苷酸序列，其包含TATAATTGCAAAATAA(SEQIDNO：1)或其变体或TTATTTTGCAATTATA(SEQIDNO：2)或其变体；第二核苷酸序列，其包含TTCTTAGCGTTT(SEQIDNO：3)或其变体；第三核苷酸序列，其包含SEQIDNO：1或其变体或SEQIDNO：2或其变体；和第四核苷酸序列，其包含SEQIDNO：3或其变体，其中第一序列与第二序列互补。在一些实施方案中，适体具有二级结构，其中所述第一和第三核苷酸序列在低于约45℃、42℃、40℃、39℃或38℃的温度下杂交以形成茎(stem)，并且第二和第三核苷酸序列中的每一个保持单链以形成环，其中茎位于由第二和第三核苷酸序列形成的环之间。在一些实施方案中，共价键存在于第一序列的5′末端和第四序列的3′末端之间。在其他实施方案中，共价键是磷酸二酯键。在一些实施方案中，SEQIDNO：1的变体包含1、2、3或4个核苷酸置换，并且第三核苷酸序列与SEQIDNO：2的变体互补，其中SEQIDNO：1和SEQIDNO：2之间不存在错配。在一些实施方案中，SEQIDNO：2的变体包含1、2、3或4个核苷酸置换，并且第一核苷酸序列与SEQIDNO：2的变体互补，其中SEQIDNO：1和SEQIDNO：2之间不存在错配。在一些实施方案中，第一序列和第三序列中的每一个序列的长度为14-18、15-16或16-17个核苷酸。在其他实施方案中，第一序列和第三序列中的每一个序列的长度为14、15、16、17或18个核苷酸。在一个具体实施方案中，第一序列和第三序列中的每一个序列的长度为16个核苷酸。在一些实施方案中，第一序列包含SEQIDNO：1，第二序列包含SEQIDNO：2。在其他实施方案中，第一序列由SEQIDNO：1组成，第二序列由SEQIDNO：2组成。在一些实施方案中，第一序列选自SEQIDNO：11-41或其变体，其中所述变体包含1、2、3或4个核苷酸置换。在其他实施方案中，第三序列与第一序列的长度相同，并且第三序列与第一序列互补，其中第一序列和第三序列之间不存在错配。在其他实施方案中，第一序列选自SEQIDNO：11-41。在一些实施方案中，第二序列沿着第二和第四序列的整体长度与第四序列相同。在一些实施方案中，第二和第四序列中的每一个序列的长度为12个核苷酸。在一些实施方案中，第二序列包含SEQIDNO：3，第四序列包含SEQIDNO：3。在其他实施方案中，第二序列由SEQIDNO：3组成，第四序列由SEQIDNO：3组成。在一些实施方案中，适体不具有5′末端或3′末端。在一些实施方案中，适体包含5′末端和3′末端，其中在第一序列内或在第二序列内的2个核苷酸之间不存在共价键。在其他实施方案中，SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的核苷酸1和2、2和3、3和4、4和5、5和6、6和7、7和8、8和9、9和10、10和11、11和12、12和13、13和14、14和15，或15和16之间不存在共价键。在一些实施方案中，第一序列包含SEQIDNO：1，第三序列包含SEQIDNO：2，并且在SEQIDNO：1的核苷酸8和9之间不存在磷酸二酯键。在其他实施方案中，第一序列包含SEQIDNO：2，第三序列包含SEQIDNO：1，并且在SEQ本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种适体，其包含5’至3’方向的以下序列：包含SEQ ID NO：1或其变体或SEQ ID NO：2或其变体的第一序列，包含SEQ ID NO：3或其变体的第二序列，包含SEQ ID NO：1或其变体或SEQ ID NO：2或其变体的第三序列，和包含SEQ ID NO：3或其变体的第四序列，其中所述第一和第三序列中的每一个序列的长度为14‑18个核苷酸，长度彼此相等，并且沿其整体长度彼此100％互补；和其中所述第二和第四序列的长度为12个核苷酸并且彼此相同。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.06.07 US 62/347,0041.一种适体，其包含5’至3’方向的以下序列：包含SEQIDNO：1或其变体或SEQIDNO：2或其变体的第一序列，包含SEQIDNO：3或其变体的第二序列，包含SEQIDNO：1或其变体或SEQIDNO：2或其变体的第三序列，和包含SEQIDNO：3或其变体的第四序列，其中所述第一和第三序列中的每一个序列的长度为14-18个核苷酸，长度彼此相等，并且沿其整体长度彼此100％互补；和其中所述第二和第四序列的长度为12个核苷酸并且彼此相同。2.权利要求1的适体，其中在第一序列的5′末端和第四序列的3′末端之间存在共价键。3.权利要求2的适体，其中所述共价键是磷酸二酯键。4.权利要求2或3的适体，其中在第一序列内的2个核苷酸之间不存在共价键，并且其中所述适体包含5′末端和3′末端。5.权利要求2或3的适体，其中在第三序列内的2个核苷酸之间不存在共价键，并且其中所述适体包含5′末端和3′末端。6.权利要求2至5中任一项的适体，其中所述第一序列包含SEQIDNO：1，所述第三序列包含SEQIDNO：2，并且SEQIDNO：1的核苷酸8和9之间不存在共价键。7.权利要求2至5中任一项的适体，其中所述第一序列包含SEQIDNO：2，所述第三序列包含SEQIDNO：2，并且SEQIDNO：2的核苷酸8和9之间不存在共价键。8.权利要求1至6中任一项的适体，其中所述第一序列包含SEQIDNO：2，所述第三序列包含SEQIDNO：3。9.前述权利要求中任一项的适体，其中所述第一和第三序列沿第一和第三序列中的每一个的整体长度彼此杂交。10.权利要求9的适体，其中所述第一和第三序列之间不存在错配。11.权利要求6的适体，其中所述适体包含SEQIDNO：106。12.权利要求7的适体，其中所述适体包含SEQIDNO：110。13.权利要求4至10中任一项的适体，其中所述5′末端被磷酸化。14.权利要求4至13中任一项的适体，其中所述3′末端与3′加帽部分连接。15.权利要求4至13中任一项的适体，其中所述5′末端与5′加帽部分连接。16.权利要求4至13中任一项的适体，其中所述3′末端与3′加帽部分连接，并且所述5′末端与5′加帽部分连接。17.权利要求14或16的适体，其中所述3′加帽部分是丙二醇间隔基(C3)或磷酸。18.权利要求15或16的适体，其中所述5′加帽部分是氨基。19.一种适体，其包含含有5′至3′方向的以下序列的寡核苷酸：包含SEQIDNO：4或其变体或SEQIDNO：5或其变体的第一多核苷酸序列，包含SEQIDNO：3或其变体的第二多核苷酸序列，和包含SEQIDNO：5或其变体或SEQIDNO：4或其变体的第三多核苷酸序列，和包含SEQIDNO：3或其变体的第四多核苷酸序列，其中所述第二和第四序列中的每一个序列的长度为14-20个核苷酸，长度相等，并且沿其整体长度彼此互补；并且其中所述适体包含5′末端和3′末端。20.权利要求19的适体，其中适体包含含有SEQIDNO：83或87的寡核苷酸。21.权利要求19的适体，其中第四序列的3′末端与第一序列的5′末端共价结合，并且在第三序列的最后一个核苷酸和第四序列的第一个核苷...

【专利技术属性】
技术研发人员：S·G·洛霍夫，A·A·高尔，V·巴拉兹奈诺克，E·V·维亚佐夫基那，I·希什金娜，D·H·佩尔森，
申请(专利权)人：塞弗德公司，
类型：发明
国别省市：美国,US