一组与结缔组织生长因子特异性结合的高亲和力核酸适配体及其应用制造技术

本发明专利技术涉及眼科学和生物技术领域，具体是一组与结缔组织生长因子(CTGF)特异性结合的高亲和力核酸适配体。本发明专利技术是基于SELEX技术筛选得到的一条特异性识别CTGF的高亲和力核酸适配体，并通过突变、截短和锁核酸替代等一系列的优化策略进一步改善核酸适配体的性能。所述的该组核酸适配体具有广阔的应用前景，可用于复杂体系中CTGF的捕获、体内外CTGF的检测以及在相关疾病中CTGF治疗药物的开发和靶向给药系统的构建等。本发明专利技术的核酸适配体面向实际应用具有巨大的潜力。

【技术实现步骤摘要】
一组与结缔组织生长因子特异性结合的高亲和力核酸适配体及其应用
本专利技术涉及眼科学和生物
，具体地说，是一组与结缔组织生长因子(CTGF)特异性结合的高亲和力核酸适配体及其应用。
技术介绍
结缔组织生长因子(connectivetissuegrowthfactor,CTGF)是近年来新发现的一种细胞因子，是高度保守的CCN家族成员之一。CTGF在人类多种组织器官中广泛表达，其在促进细胞增殖、刺激细胞迁移、介导细胞粘附、血管生成、软骨形成、骨骼发育、肿瘤的发生发展、组织修复和器官纤维化等生理和病理活动中发挥着非常重要的生物学功能。CTGF的表达水平与许多疾病相关，现已经成为多种疾病重要的诊断和治疗靶点。因此，迫切需要发展特异性识别CTGF的配体分子，从而为临床疾病中CTGF诊断试剂的制备、中和药物的开发和靶向给药系统的构建奠定基础，以及为基础研究中CTGF的捕获、富集和纯化提供有效的工具。核酸适配体作为一种新型的生物识别分子，能够高特异识别并结合靶分子。它是通过指数富集性配体系统进化技术(SystematicEvolutionofLigandsbyExponentialEnrichment,SELEX)从体外构建的随机核酸文库中筛选获得的ssDNA或者RNA分子。核酸适配体由于可化学合成、易于标记和修饰、识别靶标广泛、不受免疫原性和免疫条件的限制、高亲和力和强特异性等优点，可用于特定靶分子的分离、检测、活体内传递、中和药物开发等，在分析诊断和医药研究等领域中具有广阔的应用前景。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一组与CTGF特异性结合的高亲和力核酸适配体。本专利技术的另一目的是提供该组核酸适配体在制备CTGF检测试剂、试剂盒或传感器中；在制备CTGF捕获、富集和纯化的制剂中；在制备CTGF相关临床疾病的诊断试剂、靶向传递系统、中和或阻断药物中等多方面的应用。本专利技术通过SELEX技术筛选得到了与CTGF特异性结合的高亲和力核酸适配体，并通过突变、截短和锁核酸替代等一系列的优化策略进一步改善核酸适配体的亲和力、特异性、结构稳定性等性能，为复杂体系中CTGF的捕获和体内外CTGF检测试剂的制备及相关疾病中CTGF靶向给药系统构建和治疗药物的开发提供了一组特异性强、稳定性高、易于制备和修饰的高亲和力的生物识别分子。本专利技术的主要技术方案是：1)通过磁珠SELEX技术筛选获得了一条与CTGF特异性结合的高亲和力核酸适配体；2)通过突变优化提高了该核酸适配体的亲和力；3)通过截短优化获得了该核酸适配体的核心序列，并进一步提高了其靶向亲和力；4)通过锁核酸替代显著改善了该核酸适配体的结构稳定性等。为CTGF相关的实验室技术的开发、临床诊断方法的发展和核酸药物的挖掘提供了有效的工具。本专利技术的第一方面，提供了一组与CTGF特异性结合的高亲和力核酸适配体，其序列分别如SEQIDNo.1～SEQIDNo.11(表1)所示。表1本专利技术的第二方面，提供一组如上所述的核酸适配体在制备CTGF检测试剂、试剂盒或传感器中的应用。进一步的，所述的试剂、试剂盒或传感器可用于快速检测体内外的CTGF。本专利技术的第三方面，提供了一组如上所述的核酸适配体在制备CTGF捕获、富集和纯化制剂中的应用。进一步的，所述的制剂可以用于识别和捕获复杂样品中的CTGF，也可用于复杂体系中CTGF的富集和纯化。本专利技术的第四方面，提供一组如上所述的核酸适配体在开发CTGF相关临床疾病早期诊断新方法中的应用。进一步的，所述的早期诊断新方法可用于CTGF相关疾病的早期快速诊断。本专利技术的第五方面，提供一组如上所述的核酸适配体在构建相关临床疾病靶向给药系统中的应用。进一步的，所述的靶向给药系统是基于上述核酸适配体与CTGF特异性识别、结合和解离的作用，可用于药物的靶向运输和定点释放等。本专利技术的第六方面，提供一组如上所述的核酸适配体在制备中和或阻断CTGF的药物中的应用。进一步的，所述的核酸适配体在制备用于治疗或者缓解CTGF介导的恶性肿瘤、糖尿病肾病、糖尿病视网膜病变、类风湿性关节炎、椎间盘退化、动脉粥样硬化、心血管疾病及器官纤维化等疾病药物中的应用。本专利技术优点在于：本专利技术通过将CTGF蛋白固定在磁珠表面，基于磁珠SELEX技术进行核酸适配体的筛选。获得了一条与CTGF高亲和力、强特异结合的核酸适配体，并通过突变、截短和锁核酸替代等一系列的优化策略进一步改善核酸适配体的亲和力、特异性和结构稳定性等性能。该组核酸适配体作为特异性识别并结合CTGF的生物识别分子，具有稳定性好、灵敏度高、特异性强、免疫原性低、制备成本低、易修饰和标记等优势。该组核酸适配体具有广阔的应用前景，可用于复杂体系中CTGF的捕获、体内外CTGF的检测以及在相关疾病中CTGF治疗药物的开发和靶向给药系统的构建等。因此，本专利技术的核酸适配体面向实际应用具有巨大的潜力。附图说明图1.CTGF蛋白核酸适配体筛选示意图。图2.结合CTGF蛋白的ssDNA回收率。图3.核酸适配体APT1与CTGF的结合解离曲线。图4.核酸适配体APT1与生物标志物结合的相对信号图。图5.核酸适配体APT1M6与CTGF的结合解离曲线。图6.核酸适配体APT1M6T与CTGF的结合解离曲线。图7.核酸适配体APT1M6TL与CTGF的结合解离曲线。图8.核酸适配体APT1M6TL与生物标志物结合的相对信号图。图9.核酸适配体在97％人血清中的半衰期。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术提供的具体实施方式作详细说明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(NewYork：ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本专利技术中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。实施例1.CTGF在羧基修饰的磁珠表面的固定CTGF蛋白被固定在磁珠表面主要是基于蛋白N端的氨基与磁珠表面羧基的酰胺化反应，其具体过程为：(a)取400μL(10mg/mL)的磁珠用1mL的耦合缓冲液(25mMMES,pH＝5)冲洗3遍。再分别称取25mg的EDC和NHS，溶于600μL的耦合缓冲液后，并立刻加入到清洗好的磁珠中，充分混匀，室温旋转孵育60min后，用1mL的耦合缓冲液漂洗三次，得到活化的磁珠。(b)取200μL活化的磁珠，加入10μg的CTGF蛋白，室温旋转孵育30min。孵育结束后，用200μL的耦合缓冲液漂洗二次后，加入1M乙醇胺封闭10min，再用筛选缓冲液(含5mMMgCl2,0.01％Tween-20的D-PBS)漂洗三次后，重悬于200μL的筛选缓冲液中，4℃保存，作为正向筛选的磁珠。(c)在剩余的200μL活化的磁珠中加入乙醇胺溶液，室温旋转孵育60min。反应结束后，用筛选缓冲液漂洗数次，也重悬于200μL的筛选缓冲液中，4℃保存，用作反向筛选。实施例2.随机ssDNA文库及其引物的构建1.构建长度为80个核苷酸的随机ssDNA文库5本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一组与CTGF特异性结合的高亲和力核酸适配体，其序列分别如SEQ ID No.1～SEQ ID No.11所示。

【技术特征摘要】
1.一组与CTGF特异性结合的高亲和力核酸适配体，其序列分别如SEQIDNo.1～SEQIDNo.11所示。2.一组如权利要求1所述的核酸适配体在制备CTGF检测试剂、试剂盒或传感器中的应用。3.一组如权利要求1所述的核酸适配体在制备CTGF捕获、富集和纯化制剂中的应用。4.一组如权利要求1所述的核酸适配体在开发CTGF相关临床疾病的早期快速诊断新方法中的应用。5.一组如权利要求1所述的核酸适配体在构建相关临床疾病靶向给药系统中的应用。6.根据权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：高顺祥，吴继红，
申请(专利权)人：复旦大学附属眼耳鼻喉科医院，
类型：发明
国别省市：上海,31