一种超临界二氧化碳流体酶解制备壳寡糖的方法技术

本发明专利技术提供一种超临界二氧化碳流体酶解制备壳寡糖的方法，包括以下步骤：将壳聚糖溶液经研磨处理，喷雾干燥，得到预处理的壳聚糖粉末；将海藻酸钠溶液中加入戊二醛溶液中，室温下搅拌，加入壳聚糖酶溶液，低温搅拌交联，得到固定壳聚糖酶的海藻酸钠水溶胶，经超声波活化处理，得到活化的固定壳聚糖酶；将预处理的壳聚糖加入到超高压反应釜中，加入活化的固定壳聚糖酶，通入二氧化碳气体，加压加热使二氧化碳至超临界状态，继续升温至酶解温度，酶解，得到壳寡糖。本发明专利技术将微米级壳聚糖粉末和交联固定于海藻酸钠水凝胶体系的壳聚糖酶作为原料，借助超临界二氧化碳流体的超溶解性能，制备得到操作简便、效率高，分子量窄的壳寡糖。

A Supercritical Carbon Dioxide Fluid Enzymatic Hydrolysis Method for Preparing Chitooligosaccharides

The invention provides a method for preparing chitosoligosaccharides by enzymatic hydrolysis of supercritical carbon dioxide fluid, comprising the following steps: grinding chitosan solution and spray drying to obtain pretreated chitosan powder; adding sodium glutaraldehyde solution into alginate solution, stirring at room temperature, adding chitosan enzyme solution, stirring and crosslinking at low temperature, and obtaining sodium alginate water with fixed chitosanase. The sol was activated by ultrasound to obtain the activated immobilized chitosanase. The pretreated chitosan was added to the ultra-high pressure reactor, the activated immobilized chitosanase was added to the reactor, and the carbon dioxide gas was introduced. The supercritical state of carbon dioxide was heated under pressure, and then the temperature was raised to the enzymatic hydrolysis temperature. The chitosan oligosaccharide was obtained by enzymatic hydrolysis. The micron chitosan powder and cross-linked chitosanase immobilized in sodium alginate hydrogel system are used as raw materials to prepare chitosan oligosaccharides with simple operation, high efficiency and narrow molecular weight by means of supercritical carbon dioxide fluid supersolubility.

【技术实现步骤摘要】
一种超临界二氧化碳流体酶解制备壳寡糖的方法
本专利技术属于医用材料
，具体涉及一种超临界二氧化碳流体酶解制备壳寡糖的方法。
技术介绍
壳寡糖是壳聚糖的降解产物，壳寡糖不仅具有壳聚糖的来源丰富，生物相容性好的优点，而且分子量下降，水溶性提高，更加有利于吸收，而且还具有抗肿瘤、抗菌、免疫激活等特点，比壳聚糖具有更加广阔的应用前景。目前由壳聚糖制备壳寡糖的方法有酸解法、酶解法和物理降解法，其中酸解法制备的产物中壳寡糖的产率低，分离困难，对环境污染严重，因此，酶解法是一种绿色安全的制备壳寡糖的方法。酶解法是利用壳聚糖酶或者非专一性酶对壳聚糖进行降解的方法，反应条件温和，可专一性地切断β-1,4-糖苷键，对壳寡糖的相对分子质量可控性增强，且反应过程不需要使用大量的化学试剂，对化学污染较小，因此，酶法制备壳寡糖十分符合绿色生产的要求。中国专利CN101845471B公开的快速溶解壳聚糖、以高底物浓度酶法制备壳寡糖的方法，将壳聚糖粉末和水加入到高速剪切分散机中，得到10％～20％的壳聚糖溶液，然后将壳聚糖溶液按20～80U/g的比例加入壳聚糖水解酶，在pH为4.2～4.8和40℃～50℃下反应，降解至目标分子量后终止反应，然后将酶解产物液用碱液调节反应液pH至7.0～8.0，静置形成絮凝物，离心或过滤去水不溶性壳聚糖及其他杂质，再采用截留分子量30,000～1,000Da的超滤膜进行分级处理，同时除去分子量大的壳聚糖和酶蛋白成分，用截留分子量500Da的纳滤膜对超滤透过液进行浓缩和脱盐处理，浓缩比为1/3～1/4，采用稀释过滤的方式，脱盐次数为2～4次，脱盐率达70％～90％，再在真空度大于0.085MPa和70℃以下使浓缩液中固形物含量达25％以上，最后在进风温度170～200℃、出风温度70～90℃下喷雾干燥，得到淡黄色壳寡糖粉末状产品。中国专利CN104829749B公开的一种以虾蟹壳为原料采用酶解法一步制备壳寡糖的方法及应用，将虾蟹壳粉碎后加入稀盐酸脱钙，加入水，搅拌混合均匀得到反应物料，在pH为2.5-7和35-60℃下加入酶制剂，保持该温度进行酶解反应，随后升温蒸煮，得到混合溶液，最后将混合溶液进行固液分离，经脱色，干燥，即可得到产物壳寡糖粉体，其中，酶制剂为脱乙酰酶与选自纤维素酶、半纤维素酶、溶菌酶、几丁质酶、蛋白酶、壳聚糖酶、脂肪酶和葡萄糖酶中的一种或多种酶所组成的混合物。由上述现有技术可知，通过将酶处理技术与物理方法相结合，可提高壳寡糖的产率和效率。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种超临界二氧化碳流体酶解制备壳寡糖的方法，是将微米级壳聚糖粉末和交联固定于海藻酸钠水凝胶体系的壳聚糖酶作为原料，借助超临界二氧化碳流体的超溶解性能，制备得到操作简便、效率高，分子量窄的壳寡糖。为解决上述技术问题，本专利技术的技术方案是：一种超临界二氧化碳流体酶解制备壳寡糖的方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)将壳聚糖加入乙酸溶液中，制备得到壳聚糖溶液，将壳聚糖溶液经研磨处理，喷雾干燥，得到预处理的壳聚糖粉末；(2)将海藻酸钠溶液中加入戊二醛溶液中，室温下搅拌，加入壳聚糖酶溶液，低温搅拌交联，得到固定壳聚糖酶的海藻酸钠水溶胶，经超声波活化处理，得到活化的固定壳聚糖酶；(3)将步骤(1)制备的预处理的壳聚糖加入到超高压反应釜中，加入步骤(2)制备的活化的固定壳聚糖酶，通入二氧化碳气体，加压加热使二氧化碳至超临界状态，继续升温至酶解温度，酶解，得到壳寡糖。作为上述技术方案的优选，所述步骤(1)中，壳聚糖溶液的浓度为1-3w/v％。作为上述技术方案的优选，所述步骤(1)中，研磨处理的球磨比为5-6:1，球磨的转速为1000-2500r/min，时间为30-90min。作为上述技术方案的优选，所述步骤(2)中，海藻酸钠、戊二醛和壳聚糖酶的质量比为1:0.6-0.9:0.2-0.5。作为上述技术方案的优选，所述步骤(2)中，低温搅拌交联的温度为4-10℃，转速为200-500r/min，时间为2-4h。作为上述技术方案的优选，所述步骤(2)中，超声波活化处理的频率为12-13kHz，强度为20-25W/cm2，时间为10-20min。作为上述技术方案的优选，所述步骤(2)中，活化的固定壳聚糖酶的活力为50-70U/g。作为上述技术方案的优选，所述步骤(3)中，加压加热的压力为7.4-8MPa，温度为33-40℃。作为上述技术方案的优选，所述步骤(3)中，酶解的温度为45-50℃，酶解时间为45-90min，pH值为6-6.5。作为上述技术方案的优选，所述步骤(3)中，壳寡糖的分子量为1200-1500。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：(1)本专利技术制备方法是选用预处理的壳聚糖粉末作为原料，壳聚糖溶液经物理研磨处理后，大分子之间的氢键断裂，分子之间的结合力下降，再经喷雾干燥处理，有利于得到微米级的壳聚糖粉末，该预处理的微米级壳聚糖粉末不仅粒径小，具有一定的孔隙结构，而且壳聚糖大分子之间结构疏松，有利于之后超临界二氧化碳流体和壳聚糖酶的渗入，为之后的酶解工艺打下良好的基础。(2)本专利技术制备方法使用的酶为壳聚糖酶，壳聚糖酶是专一性酶，壳聚糖酶可特异性地切断GlcN-GlcN的糖苷键，使制备的壳寡糖的还原端只有GlcNAc基团，使制备的壳寡糖的水溶性更好，性能更加稳定均一，具有抗菌、抗肿瘤、抑制肿瘤转移和提高免疫力的作用，且本专利技术使用的壳聚糖酶是通过戊二醛作为交联剂，一边通过Schiff反应将壳聚糖酶固定其中，一边与海藻酸钠中的羟基反应，因此将壳聚糖酶牢固的固定于海藻酸钠的水凝胶三维网络中，不仅保留了壳聚糖酶的活力，而且使壳聚糖酶免收外界的干扰，稳定性好。此外，本专利技术还对固定的壳聚糖酶进行微波活化处理，通过适宜的超声波作用，使微波具有的空穴作用和机械振荡作用进入酶的催化部位，使壳聚糖酶折叠的更加合理，更有利于与壳聚糖的作用，既而提高壳聚糖酶的活性。(3)本专利技术制备方法中采用超临界二氧化碳流体作为介质，借助超临界流体兼具液体和气体的优点，使微米级壳聚糖颗粒与壳聚糖酶快速充分接触，在超临界二氧化碳流体渗入壳聚糖颗粒内部的同时，将壳聚糖酶也迅速带入壳聚糖内部，基于壳聚糖大分子之间松动，使壳聚糖酶可以更加快速的对壳聚糖大分子进行酶解，既而可以快速高效地实现壳聚糖的酶解，制备得到分子量窄的壳寡糖。(4)本专利技术的制备方法是基于酶在超临界流体中酶活力几乎无损失的前提下，通过将物理预处理工艺与超临界技术相结合，可快速高效，反应温和的制备得到高质量的壳寡糖，产物的产量高，效率高，具有很好的推广价值。具体实施方式下面将结合具体实施例来详细说明本专利技术，在此本专利技术的示意性实施例以及说明用来解释本专利技术，但并不作为对本专利技术的限定。实施例1：(1)将壳聚糖加入乙酸溶液中，制备得到1w/v％壳聚糖溶液，将壳聚糖溶液研磨处理30min，研磨处理的球磨比为5:1，球磨的转速为1000r/min，喷雾干燥，得到粒径为50-800μm的预处理的壳聚糖粉末。(2)按照海藻酸钠、戊二醛和壳聚糖酶的质量比为1:0.6:0.2，将海藻酸钠溶液中加入2％的戊二醛溶液中，室温下，以1500r/min的转速搅拌30min，加入壳聚糖酶溶液，在4℃下，以200r/m本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种超临界二氧化碳流体酶解制备壳寡糖的方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)将壳聚糖加入乙酸溶液中，制备得到壳聚糖溶液，将壳聚糖溶液经研磨处理，喷雾干燥，得到预处理的壳聚糖粉末；(2)将海藻酸钠溶液中加入戊二醛溶液中，室温下搅拌，加入壳聚糖酶溶液，低温搅拌交联，得到固定壳聚糖酶的海藻酸钠水溶胶，经超声波活化处理，得到活化的固定壳聚糖酶；(3)将步骤(1)制备的预处理的壳聚糖加入到超高压反应釜中，加入步骤(2)制备的活化的固定壳聚糖酶，通入二氧化碳气体，加压加热使二氧化碳至超临界状态，继续升温至酶解温度，酶解，得到壳寡糖。

【技术特征摘要】
1.一种超临界二氧化碳流体酶解制备壳寡糖的方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)将壳聚糖加入乙酸溶液中，制备得到壳聚糖溶液，将壳聚糖溶液经研磨处理，喷雾干燥，得到预处理的壳聚糖粉末；(2)将海藻酸钠溶液中加入戊二醛溶液中，室温下搅拌，加入壳聚糖酶溶液，低温搅拌交联，得到固定壳聚糖酶的海藻酸钠水溶胶，经超声波活化处理，得到活化的固定壳聚糖酶；(3)将步骤(1)制备的预处理的壳聚糖加入到超高压反应釜中，加入步骤(2)制备的活化的固定壳聚糖酶，通入二氧化碳气体，加压加热使二氧化碳至超临界状态，继续升温至酶解温度，酶解，得到壳寡糖。2.根据权利要求1所述的一种超临界二氧化碳流体酶解制备壳寡糖的方法，其特征在于：所述步骤(1)中，壳聚糖溶液的浓度为1-3w/v％。3.根据权利要求1所述的一种超临界二氧化碳流体酶解制备壳寡糖的方法，其特征在于：所述步骤(1)中，研磨处理的球磨比为5-6:1，球磨的转速为1000-2500r/min，时间为30-90min。4.根据权利要求1所述的一种超临界二氧化碳流体酶解制备壳寡糖的方法，其特征在于：所述步骤(2)中，海藻酸钠、戊二醛和壳聚糖酶的质量比为1:0....

【专利技术属性】
技术研发人员：方旭波，陈小娥，袁高峰，迟海波，孙海燕，
申请(专利权)人：浙江海洋大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33