有核红细胞模拟粒子及其制备方法与应用技术

有核红细胞模拟粒子及其制备方法与应用，属于医学检测技术领域。解决了如何提供一种工艺简单、产率高、产物稳定性好的有核红细胞模拟粒子的制备方法的问题。本发明专利技术的制备方法：先分离并洗涤红细胞，得到纯化红细胞；然后用稀释液稀释纯化红细胞，加入加载剂，在脉冲电磁场的作用下将加载剂引入到纯化红细胞内；再向引入加载剂后的细胞中加入细胞固定液，18‑28℃固定，洗涤细胞，用细胞保存液保存，得到有核红细胞模拟粒子。该制备步骤简单，所用试剂成分较单一，制得的产物产率较高，适合大量的生产。

Nucleated erythrocyte mimetic particles and their preparation methods and Applications

The preparation method and application of nucleated erythrocyte simulated particles belong to the technical field of medical detection. The problem of how to provide a preparation method of nucleated erythrocyte simulated particles with simple process, high yield and good product stability was solved. The preparation method of the present invention is as follows: firstly, the red blood cells are separated and washed to obtain the purified red blood cells; secondly, the red blood cells are diluted and purified with diluent, and then the loader is introduced into the purified red blood cells under the action of pulsed electromagnetic field; secondly, the cells after the loader is introduced are fixed at 18 28 C, the cells are washed and preserved with the cell preservation solution, and the nucleated red cells are obtained. Cell mimic particles. The preparation procedure is simple, the composition of reagent used is single, and the yield of the product is high, which is suitable for large-scale production.

【技术实现步骤摘要】
有核红细胞模拟粒子及其制备方法与应用
本专利技术属于医学检测
，具体涉及一种有核红细胞模拟粒子及其制备方法与应用。
技术介绍
正常的人的成熟红细胞不含有细胞核，主要成分是蛋白质和铁，具备运输氧的能力，有核红细胞属于红细胞发育过程中的初始幼稚状态，一般存在于骨髓中，但一些病理情况下，外周血内也会出现有核红细胞(NRBC)，对人体血液中有核红细胞的检测，可以为一些疾病的诊断提供依据。其临床意义如下：1、增生性贫血：最常见于各种贫血，急性失血性贫血、巨幼红细胞性贫血、严重的低色素性贫血；以出现晚幼红细胞或中幼红细胞为多见；外周血中出现有核红细胞表示骨髓中红细胞系增生明显活跃；2、红血病、红白血病：骨髓中幼稚红细胞异常增生并释放入血，以原红细胞、早幼红细胞为多见；3、髓外造血：骨髓纤维化时，脾、肝、淋巴结等组织恢复胚胎时期的造血功能，这些组织因缺乏对血细胞释放的调控能力，幼稚血细胞大量进入外周血；各发育阶段的幼红细胞都可见到，并可见到幼稚粒细胞及巨核细胞；4、其他：如骨髓转移癌、严重缺氧等。目前，越来越多的血细胞分析仪具有检测有核红细胞的功能，为了保证测值的准确性，需对其进行质量控制，即使用含有有核红细胞模拟粒子的质控品进行检测。美国专利US5559037(Kim等人)公开了一种用于有核红细胞和白细胞的流式细胞计数分析的方法。该方法使用了荧光、低角度光散射和轴光损失测量法，以便从白色血样中分辨出NRBC。美国专利US5879900(Kim等人)进一步地公开了一种辨别NRBC、白细胞和受损白细胞的方法，以及通过流式细胞仪提供血液样品中的白细胞差别的方法，这种方法的缺点是准确性不高。美国专利US7176031和US6962817公开了使用人工合成粒子模拟人有核红细胞的方法。这种方法的缺陷在于合成粒子的生产工艺复杂，成本较高。美国专利US7354767公开了使用普通哺乳动物红细胞(不含细胞核)制备有核红细胞模拟粒子的方法。这种方法制备的模拟粒子与人有核红细胞的细胞核大小接近，适用于采用阻抗法检测有核红细胞的血液细胞分析仪。但这种模拟粒子不含细胞核，不适于模拟人有核红细胞被特定荧光染料染色后的荧光特性。美国专利US7195919公开的技术方案通过在红细胞表面连接生物大分子(如：核酸、肤链等)，使其能够模拟人有核红细胞的荧光特性。这种方法的不足之处在于工艺复杂，且作为原料的生物大分子成本较高。美国专利US6723563和US6653137提出用鸟类(如火鸡或鸡)、爬行类(如短吻鳄)或鱼类(如蛙鱼)的红细胞为原料制备有核红细胞模拟粒子。美国专利US6406915、US6403377、US6399388、US6221668和US6200500公开了使用火鸡红细胞制备有核红细胞模拟粒子的方法。美国专利US6448085公开了使用鸡红细胞制备有核红细胞模拟粒子的方法。美国专利US6187590和US5858790公开了使用火鸡、鸡和蛙蹲类鱼的红细胞制备有核红细胞模拟粒子的方法。美国专利US7285417、US7135341和US7198953公开了使用短吻鳄红细胞制备有核红细胞模拟粒子的方法。这些技术方案的共同点是：使用带有细胞核的动物红细胞，包括鸟类、爬行类和鱼类的红细胞模拟人有核红细胞。这种方法的不足之处在于，绝大多数鸟类、爬行类和鱼类的红细胞呈椭圆形，与近圆形的人类有核红细胞形态差异较大。因此在某些情况下，这些动物有核红细胞并不能很好的模拟人有核红细胞的特征。例如，运用流式细胞术对细胞进行检测时，椭圆形细胞通过流动室方向不一致，因而产生大小差异很大的前向散射光信号，而圆形或近圆形细胞则不会出现这种状况。由此可见，现有技术中制备有核红细胞模拟粒子的方法均具有一定的缺点，亟需一种工艺简单、产率高、产物稳定性好的有核红细胞模拟粒子的制备方法。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的是如何提供一种工艺简单、产率高、产物稳定性好的有核红细胞模拟粒子的制备方法，并提供该方法制备的有核红细胞模拟粒子作为以荧光-散射光法为检测原理的细胞血液分析仪的质控物的应用。本专利技术实现上述目的采取的技术方案如下。有核红细胞模拟粒子的制备方法，步骤如下：步骤一、分离并洗涤红细胞，得到纯化红细胞；步骤二、用稀释液稀释纯化红细胞，加入加载剂，在脉冲电磁场的作用下将加载剂引入到纯化红细胞内；所述加载剂为人工合成的DNA或RNA片段，加载剂的添加量大于1.5μg/L且在3.0μg/L以内；步骤三、向引入加载剂后的细胞中加入细胞固定液，18-28℃固定，洗涤细胞，用细胞保存液保存，得到有核红细胞模拟粒子。优选的是，所述步骤一中，红细胞为人红细胞或者MCV与人红细胞类似的哺乳动物红细胞。优选的是，所述步骤二中，用稀释液稀释纯化红细胞至1012-1014个/L。优选的是，所述步骤二中，稀释液的pH值为7.1-7.5，由ATP、MgCl2、KH2PO4、NaHCO3、葡萄糖和水组成，ATP的浓度为0.1％-1.0％，MgCl2的浓度为0.1％-0.5％，KH2PO4浓度为0.5％-3.0％，NaHCO3浓度为0.05％-0.3％，葡萄糖的浓度0.01％-0.1％。优选的是，所述步骤二中，将脉冲电磁场的作用下将加载剂引入到纯化红细胞内的过程为：电穿孔仪器90-120V电压刺激4-8秒钟。优选的是，所述步骤一和步骤三中，洗涤采用的洗涤剂包括缓冲液、防腐剂、无机盐和水。优选的是，所述步骤三中，细胞固定液包括固定剂、缓冲液、乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)、防腐剂和水；固定剂为甲醛、乙醛、戊二醛、多聚甲醛、甲醇、丙酮中的一种或多种；固定时间为3-5h。优选的是，所述步骤三中，细胞保存液包括缓冲液、营养成分、防腐剂和水。本专利技术还提供上述有核红细胞模拟粒子的制备方法制备的有核红细胞模拟粒子。本专利技术还提供上述有核红细胞模拟粒子作为以核酸荧光染色为检测原理的血液细胞分析仪的质控物的应用。与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：本专利技术的有核红细胞模拟粒子的制备方法，运用电脉冲刺激细胞的方式将核酸物质引入成熟红细胞内制备出有核红细胞模拟粒子，该模拟粒子制备步骤简单，所用试剂成分较单一，制得的产物产率较高，适合大量的生产。附图说明图1显示的是未经电脉冲刺激细胞引入核酸物质的有核红细胞模拟粒子，与成熟红细胞模拟物按质量比1:4混合配制血液分析仪用的全血质控物，在以核酸荧光染色为检测原理的血液细胞分析仪上测试图片(仅提供有核红细胞通道)。图2显示的是实施例1所制备的有核红细胞模拟粒子，与成熟红细胞模拟物按质量比1:4混合配制血液分析仪用的全血质控物，在以核酸荧光染色为检测原理的血液细胞分析仪上测试图片(仅提供有核红细胞通道)。图3显示的是实施例2所制备的有核红细胞模拟粒子，与成熟红细胞模拟物按质量比1:4混合配制血液分析仪用的全血质控物，在以核酸荧光染色为检测原理的血液细胞分析仪上测试图片(仅提供有核红细胞通道)。图4显示的是实施例3所制备的有核红细胞模拟粒子，与成熟红细胞模拟物按质量比1:4混合配制血液分析仪用的全血质控物，在以核酸荧光染色为检测原理的血液细胞分析仪上测试图片(仅提供有核红细胞通道)。具体实施方式为了进一步理解本专利技术，下面对本专利技术优选实施方案进行描述，但是应当理解，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.有核红细胞模拟粒子的制备方法，步骤如下：步骤一、分离并洗涤红细胞，得到纯化红细胞；步骤二、用稀释液稀释纯化红细胞，加入加载剂，在脉冲电磁场的作用下将加载剂引入到纯化红细胞内；所述加载剂为人工合成的DNA或RNA片段，加载剂的添加量大于1.5μg/L且在3.0μg/L以内；步骤三、向引入加载剂后的细胞中加入细胞固定液，18‑28℃固定，洗涤细胞，用细胞保存液保存，得到有核红细胞模拟粒子。

【技术特征摘要】
1.有核红细胞模拟粒子的制备方法，步骤如下：步骤一、分离并洗涤红细胞，得到纯化红细胞；步骤二、用稀释液稀释纯化红细胞，加入加载剂，在脉冲电磁场的作用下将加载剂引入到纯化红细胞内；所述加载剂为人工合成的DNA或RNA片段，加载剂的添加量大于1.5μg/L且在3.0μg/L以内；步骤三、向引入加载剂后的细胞中加入细胞固定液，18-28℃固定，洗涤细胞，用细胞保存液保存，得到有核红细胞模拟粒子。2.根据权利要求1所述的有核红细胞模拟粒子的制备方法，其特征在于，所述步骤一中，红细胞为人红细胞或者MCV与人红细胞类似的哺乳动物红细胞。3.根据权利要求1所述的有核红细胞模拟粒子的制备方法，其特征在于，所述步骤二中，用稀释液稀释纯化红细胞至1012-1014个/L。4.根据权利要求1所述的有核红细胞模拟粒子的制备方法，其特征在于，所述步骤二中，所述稀释液pH值7.1-7.5，由ATP、MgCl2、KH2PO4、NaHCO3、葡萄糖和水组成，ATP的浓度为0.1％-1.0％，MgCl2的浓度为0.1％-0.5％，KH2PO4浓度为0.5％...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘旭，蔡清华，王丹凤，林月，朱子是，魏学芹，
申请(专利权)人：迪瑞医疗科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：吉林,22