一种用于红汁乳菇鉴定的特异性DNA片段、扩增引物及红汁乳菇的鉴定方法技术

本发明专利技术提供了一种用于红汁乳菇鉴定的特异性DNA片段、扩增引物及红汁乳菇的鉴定方法，属于真菌物种鉴定技术领域。用于红汁乳菇鉴定的特异性DNA片段，具有如序列表中SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。用于扩增所述的特异性DNA片段的引物，包括Tb1引物和Tb2引物。红汁乳菇的鉴定方法，包括以下步骤：提取待检菌的基因组DNA；以基因组DNA为模板，用Tb1引物和Tb2引物进行PCR扩增；将扩增产物电泳；根据电泳图的条带判断是否为红汁乳菇；若电泳图中仅出现一条230bp大小的条带，则待检菌为红汁乳菇。所述方法能够实现从真菌中快速、准确地鉴定红汁乳菇。

A Method for Identification of Specific DNA Fragments, Amplified Primers and Lactarius rubra

The invention provides a method for identifying specific DNA fragments, amplified primers and Lactarius rubra for identification, belonging to the technical field of fungal species identification. Specific DNA fragments for identification of Lactarius rubra have nucleotide sequences such as SEQ ID No.1 in the sequence list. The primers used for amplifying the specific DNA fragment include Tb1 primer and Tb2 primer. The identification method of Lactarius rubra includes the following steps: extracting genomic DNA of the bacteria to be tested; using genomic DNA as template, using Tb1 and Tb2 primers for PCR amplification; electrophoresis of the amplified products; judging whether it is Lactarius rubra according to the bands of electrophoresis map; if only a 230bp-sized band appears in the electrophoresis map, the bacteria to be tested is Lactarius rubra. The method can quickly and accurately identify Lactarius rubra from fungi.

【技术实现步骤摘要】
一种用于红汁乳菇鉴定的特异性DNA片段、扩增引物及红汁乳菇的鉴定方法
本专利技术属于真菌物种鉴定
，具体涉及一种用于红汁乳菇鉴定的特异性DNA片段、扩增引物及红汁乳菇的鉴定方法。
技术介绍
野生食用菌是一种重要的森林资源，在绿色食品开发、生物制药、环境保护等行业中发挥着重要的作用，特别是生长在林区的一些野生食用菌。红汁乳菇(Lactariushatsudake)，云南俗称铜绿菌、铜锣菌，是世界著名的美味野生食用菌，具有很高的经济价值，长期供不应求。该菌除鲜食外，还可加工成菌油，或经速冻后长期保，具有巨大的规模开发的市场前景。此菌试验抗癌，对小白鼠肉瘤的抑制率为100％，对艾氏癌的抑制率为90％，它与松等树木形成外生菌根。在这些野生食用菌的分类及其菌丝体分离物的鉴定方面，人们主要根据野生食用菌子实体的形态学、解剖学等特征来确定菌种。野生食用菌不产生子实体或尚未找到子实体时，就无法进行野生食用菌菌种的鉴定。即使是从野生食用菌的子实体上分离到纯菌种，为避免伴生菌和杂菌的污染所产生的误导，也应遵循柯赫法则进行回接试验，产生相同子实体的鉴定方法是令人信服的。遗憾的是现在很多珍贵的野生食用菌，尚未成功人工栽培出菇，在这种情况下就很难断定分离菌株的真伪。红汁乳菇为乳菇属的野生食用菌，具有独特的口感。目前，真菌类采用DNA分子的方法鉴定一般使用ITS基因进行，但是由于近源种中存在保守序列，不能将目标菌与近源菌区分开，例如，红汁乳菇与红菇属中的青头菌用真菌ITS通用引物ITS4/ITS5扩增，无法鉴定红汁乳菇。目前使用的分子鉴定的DNA区段无法特异性鉴定红汁乳菇物种。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种用于红汁乳菇鉴定的特异性DNA片段、扩增引物及红汁乳菇的鉴定方法，能够从真菌中快速、准确地鉴定红汁乳菇。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了一种用于红汁乳菇鉴定的特异性DNA片段，所述特异性DNA片段具有如序列表中SEQIDNo.1所示的核苷酸序列。本专利技术提供了一种用于扩增所述的特异性DNA片段的引物，包括Tb1引物和Tb2引物；所述Tb1引物具有如序列表中SEQIDNo.2所示的核苷酸序列；所述Tb2引物具有如序列表中SEQIDNo.3所示的核苷酸序列。本专利技术提供了一种红汁乳菇的鉴定方法，包括以下步骤：(1)提取待检菌的基因组DNA；(2)以所述步骤(1)中提取的基因组DNA为模板，用上述方案中的引物进行PCR扩增，得到扩增产物；(3)将所述步骤(2)中扩增产物电泳，得到电泳图；(4)根据电泳图的条带判断是否为红汁乳菇；若电泳图中仅出现一条230bp大小的条带，说明待检菌为红汁乳菇。优选的，所述PCR扩增的体系为PCR扩增MIX液22.5μl、所述Tb1引物1μl、所述Tb2引物1μl和DNA3μl。优选的，所述PCR扩增的程序如下：98℃预变性2min；然后98℃变性20s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共35次循环；最后72℃延伸5min。优选的，所述电泳用琼脂糖凝胶的质量浓度为1.5％～2.5％。优选的，所述电泳的电压为90V，所述电泳的电流为78mA。本专利技术提供了一种用于红汁乳菇鉴定的特异性DNA片段，所述特异性DNA片段具有如序列表中SEQIDNo.1所示的核苷酸序列。所述特异性DNA片段为红汁乳菇的基因组DNA中所特有的，能够使之区别与其他真菌，具有特异性强的特点。本专利技术提供了基于上述特异性DNA片段鉴定红汁乳菇的方法，采用PCR扩增的方法能够准确特异性扩增上述特异性DNA片段，根据电泳图中特异性DNA片段产生的230bp条带的存在判断待检菌为红汁乳菇。本专利技术提供的鉴定方法不仅能从多种远缘真菌中鉴定红汁乳菇，而且还能用于区别于红汁乳菇同属的近源菌，实现了从真菌中快速、准确地鉴定红汁乳菇。附图说明图1为待检菌的PCR产物的电泳图，其中Y为阴性对照；T1为红汁乳菇；Q1为青头菌；M为2000marker；图2为本专利技术实施例2中PCR扩增电泳图。具体实施方式本专利技术提供了一种用于红汁乳菇鉴定的特异性DNA片段，所述特异性DNA片段具有如序列表中SEQIDNo.1所示的核苷酸序列。所述用于红汁乳菇鉴定的特异性DNA片段的来源可以委托序列合成公司合成得到。所述特异性DNA片段属于真菌转录间隔区(ITS)的部分序列。所述特异性DNA片段的长度为230bp。本专利技术提供了一种用于扩增所述的特异性DNA片段的引物，包括Tb1引物和Tb2引物；所述Tb1引物具有如序列表中SEQIDNo.2所示的核苷酸序列；所述Tb2引物具有如序列表中SEQIDNo.3所示的核苷酸序列。在本专利技术中，所述引物的来源可以委托序列合成公司合成得到。在本专利技术实施例中，所述引物的合成委托昆明硕擎生物科技有限公司进行。本专利技术对所述引物的设计方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的引物设计方法即可。本专利技术提供了一种红汁乳菇的鉴定方法，包括以下步骤：(1)提取待检菌的基因组DNA；(2)以所述步骤(1)中提取的基因组DNA为模板，用权利要求2所述的引物进行PCR扩增，得到扩增产物；(3)将所述步骤(2)中扩增产物电泳，得到电泳图；(4)根据电泳图的条带判断是否为红汁乳菇；若电泳图中仅出现一条230bp大小的条带，说明待检菌为红汁乳菇。本专利技术提取待检菌的基因组DNA。本专利技术对所述提取方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的手提或试剂盒均可。在本专利技术实施例中，所述提取方法优选采用凯杰公司的DNAIsolationKit(货号为：12888-50)按照说明书的步骤进行DNA提取。提取得到的基因组DNA进行核酸定量检测。基因组DNA浓度高时用缓冲液进行稀释。在PCR扩增时，所述基因组DNA的浓度优选为25ng/μl。提取基因组DNA后，本专利技术以所述提取的基因组DNA为模板，用上述方案中的引物进行PCR扩增，得到扩增产物。本专利技术对所述PCR扩增的方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的PCR扩增方法即可。本专利技术对所述PCR扩增用仪器没有特殊限制，采用本领域技术人员常见型号的PCR仪即可。在本专利技术中，所述PCR扩增的体系优选为PCR扩增MIX液22.5μl、所述Tb1引物1μl、所述Tb2引物1μl和DNA3μl。所述PCR扩增的程序优选如下：98℃预变性2min；然后98℃变性20s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共35次循环；最后72℃延伸5min。得到扩增产物后，本专利技术将所述扩增产物电泳，得到电泳图。在本专利技术中，所述电泳用琼脂糖凝胶的质量浓度优选为1.5％～2.5％，更优选为2％。所述电泳时扩增产物的点样体积优选为2μl。在本专利技术中，所述电泳的电压优选为90V，所述电泳的电流优选为78mA。本专利技术对所述电泳的方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的电泳方法即可。电泳结束后，将电泳凝胶染色，再用紫外透射仪检测拍照，得到电泳图。所述染色用染料为GeneFinderTM。得到电泳图后，根据电泳图的条带判断是否为红汁乳菇；若电泳图中仅出现一条230bp大小的条带，说明待检菌为红汁乳菇；若电泳图中没有230bp大小的条带，说明待检菌不是红汁乳菇。下面结合实施例对本专利技术提供的一种用于红汁乳菇鉴定的特异性DNA片段本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于红汁乳菇鉴定的特异性DNA片段，其特征在于，所述特异性DNA片段具有如序列表中SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种用于红汁乳菇鉴定的特异性DNA片段，其特征在于，所述特异性DNA片段具有如序列表中SEQIDNo.1所示的核苷酸序列。2.一种用于扩增权利要求1所述的特异性DNA片段的引物，其特征在于，包括Tb1引物和Tb2引物；所述Tb1引物具有如序列表中SEQIDNo.2所示的核苷酸序列；所述Tb2引物具有如序列表中SEQIDNo.3所示的核苷酸序列。3.一种红汁乳菇的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)提取待检菌的基因组DNA；(2)以所述步骤(1)中提取的基因组DNA为模板，用权利要求2所述的引物进行PCR扩增，得到扩增产物；(3)将所述步骤(2)中扩增产物电泳，得到电泳图；(4)根据电泳图的条带判断是否为红...

【专利技术属性】
技术研发人员：沙涛，杨小雨，张亚平，王丁卉，何志红，
申请(专利权)人：云南大学，
类型：发明
国别省市：云南,53