一种基于MIX抗原包被的HCV NS3抗体检测方法技术

发明专利技术提出了一种基于MIX抗原包被的HCV NS3抗体酶免疫法检测方法，包被:分别将HCV NS3(1型和6型)MIX抗原用0.01mol/LPBS(pH 7.2)稀释后包被微孔板，100μl/孔，放置4℃冰箱过夜，次日用1×PBST液洗涤3次，扣干密封，4℃储存备用；加样：将稀释的酶标二抗(羊抗人‑IgG)加入酶标孔，100μl/孔，再依次加入1μl血清标本，分为空白对照组、阴性对照组和阳性对照组、待测血清，轻拍混匀；温育：置37℃温育1小时；基于目前国内HCV抗体检测试剂仍不够完善的现状，结合中国本土HCV基因型分布的特点，建立一种以MIX抗原包被的HCV NS3酶免疫法抗体检测方法，以提高HCV抗体的检出率，从而减少HCV感染者的漏检。

Detection of HCV NS3 Antibody Based on MIX Antigen Coating

An enzymatic immunoassay for detection of HCV NS3 antibody based on MIX antigen coating was developed. Coating: HCV NS3 (type 1 and 6) MIX antigen was diluted with 0.01mol/LPBS (pH 7.2) and then coated with microporous plate, 100 ml/hole, placed in a refrigerator at 4 C overnight, washed with 1 *PBST solution three times the next day, withheld and sealed, and stored at 4 (?) for reserve; Sampling: adding diluted enzyme-labeled second antibody (sheep anti-human IgG) to the enzyme label. Pore, 100 ml/pore, and then add 1 ml serum sample in turn, divided into blank control group, negative control group and positive control group, the serum to be tested, gently pat and mix; incubation: incubation at 37 C for 1 hour; based on the current situation that domestic HCV antibody detection reagents are still not perfect, combined with the characteristics of the distribution of HCV genotypes in China, an enzyme immunoassay antibody for HCV NS3 coated with MIX antigen was established. Detection methods to improve the detection rate of HCV antibodies, so as to reduce the omission of HCV infection.

【技术实现步骤摘要】
一种基于MIX抗原包被的HCVNS3抗体检测方法
本专利技术涉及生物技术诊断
，具体为一种基于MIX抗原包被的HCVNS3抗体检测方法。
技术介绍
目前普遍使用酶免疫法(EIA)检测抗-HCV作为丙型肝炎(HC)诊断指标，国内目前在对献血员抗-HCV进行常规筛选，使得输血后HC的发生率大为减少，但仍有部分受血者发生输血后HC，这一结果证实目前国内的HCV检测试剂还不够完善；HCV易发生变异，其基因序列具有高度异质性。目前HCV被划分为6个基因型，20多个基因亚型，不同基因型的HCV广泛分布于世界不同地区，在亚洲，HCV有1、2、6型分布，在中国以1b型为主，但混合感染明显高于其他国家和地区，HCV基因组序列的变异和基因组编码蛋白抗原性、生物学性质的变异相关，这对于HCV的血清学抗体检测结果有重要影响。HCV抗体试剂盒的核心是抗原成分，非结构区3(NS3)抗原是目前抗-HCVEIA检测试剂中的核心成分之一。NS3蛋白具有很强的抗原性，但该区基因序列在HCV不同基因型和亚型中的变异性较大，因此以特定基因型(亚型)的HCV抗原检测其它型(亚型)HCV感染标本时，抗原性会受到这种差异性的制约而影响检出率。然而，目前市场上所提供的检测试剂盒中所用NS3抗原均来自HCV基因型1型，1型抗原试剂对于非1型的HCV的抗体检测必然会受到基因序列的异质性的影响。不同基因型HCVNS3蛋白抗原性存在明显差异，所以在发展HCV血清学诊断试剂应该考虑到不同基因型NS3抗原性差异对抗体检测的影响。中国本土主要以基因型1型为主，但是仍存在有其它基因型的混合感染，因此以特定基因型为1型的NS3抗原不能同样有效地检测其它基因型的抗体。基于以上并结合中国本土基因型分布的特点，在比较了1型和6型两种不同基因型NS3抗原性的差异基础上，将1型和6型NS3重组抗原按比例混合(MIX抗原)作为包被抗原应用到抗体检测中，将其应用到HCV的抗体检测，使得比单纯应用1型NS3抗原检测的效率得到提高。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是克服现有的缺陷，提供一种基于MIX抗原包被的HCVNS3抗体EIA检测方法，基于目前国内HCV抗体检测试剂仍不够完善的现状，结合中国本土HCV基因型分布的特点，建立一种以MIX抗原包被的HCVNS3抗体EIA检测方法，以提高HCV抗体的检出率，从而减少HCV感染者的漏检，可以有效解决
技术介绍
中的问题。为实现上述目的，本专利技术提出：一种基于MIX抗原包被的HCVNS3抗体EIA检测方法，(1)包被:分别将HCVNS3(1型和6型)MIX抗原用0.01mol/LPBS(pH7.2)稀释后包被微孔板，100μl/孔，放置4℃冰箱过夜，次日用1×PBST液洗涤3次，扣干密封，4℃储存备用；(2)加样：将稀释的酶标二抗(羊抗人-IgG)加入酶标孔，100μl/孔，再依次加入1μl血清标本，分为空白对照组、阴性对照组和阳性对照组、待测血清，轻拍混匀；(3)温育：置37℃温育1小时；(4)洗涤：弃去孔内液体，PBST液洗涤4遍，扣干；(5)显色：分别向空白对照组、阴性对照组和阳性对照组、待测血清的每孔加底物A液、底物B液各50μl，轻拍混匀，置37℃温育10分钟；(6)加入终止液50μl，轻拍混匀；(7)测定：酶标仪以空白对照孔调零，在波长450nm处测定各孔OD450值，打印测定结果；作为本专利技术的一种优选技术方案：包被稀释液由PBS、NaCl、KCl、Na2HPO4·12H2O、KH2PO4双蒸水组成，0.01mol/LPBS，NaCl8.0g、KCl0.2g、Na2HPO4·12H2O3.58g，KH2PO40.2g，加双蒸水至1L，调pH至7.2。作为本专利技术的一种优选技术方案：碳酸盐缓冲液由Na2CO3、NaHCO3、Na2N3、双蒸水组成，Na2CO31.5g、NaHCO32.9g、Na2N30.2g加双蒸水至1000ml调至pH9.6。作为本专利技术的一种优选技术方案：酶标二抗稀释液Ⅰ由20％甘油、30％小牛血清、50％0.01mol/LPBST组成。作为本专利技术的一种优选技术方案：酶标二抗稀释液Ⅱ由NaCl、硫柳汞、Tween-20、二甲基亚砜、小牛血清、磷酸盐缓冲液组成，1.31gNaCl、0.005g硫柳汞、45μlTween-20、135μl二甲基亚砜、5ml小牛血清、45ml0.01mol/LpH7.4磷酸盐缓冲液(PB)混合。作为本专利技术的一种优选技术方案：洗涤液由NaCl、KCl、Na2HPO4·12H2O、KH2PO4、Tween-20、双蒸水组成，NaCl8.0g，KCl0.2g，Na2HPO4·12H2O3.58g，KH2PO40.2g，Tween-200.5ml，加双蒸水至1L，调pH至7.2。作为本专利技术的一种优选技术方案：底物液A由四甲基联苯胺、无水乙醇、双蒸水组成，四甲基联苯胺200mg和无水乙醇100ml、加双蒸水至1L。作为本专利技术的一种优选技术方案：底物液A由四甲基联苯胺、DMSO组成，四甲基联苯胺200mg和DMSO100ml、加双蒸水至1L。作为本专利技术的一种优选技术方案：底物液B由Na2HPO4、柠檬酸、0.75％过氧化氢尿素、双蒸水组成，Na2HPO414.6g、柠檬酸9.33g、0.75％过氧化氢尿素6.4ml加双蒸水至1L，调pH至7.2。作为本专利技术的一种优选技术方案：终止液为2mol/L的H2SO4溶液。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：基于目前国内HCV抗体检测试剂仍不够完善的现状，结合中国本土HCV基因型分布的特点，建立一种以MIX抗原包被的HCVNS3抗体EIA检测方法，以提高HCV抗体的检出率，从而减少HCV感染者的漏检。具体实施方式下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。本专利技术提供以下技术方案：一种基于MIX抗原包被的HCVNS3抗体EIA检测方法，(1)包被:分别将HCVNS3(1型和6型)MIX抗原用0.01mol/LPBS(pH7.2)稀释后包被微孔板，100μl/孔，放置4℃冰箱过夜，次日用1×PBST液洗涤3次，扣干密封，4℃储存备用；(2)加样：将稀释的酶标二抗(羊抗人-IgG)加入酶标孔，100μl/孔，再依次加入1μl血清标本，分为空白对照组、阴性对照组和阳性对照组、待测血清，轻拍混匀；(3)温育：置37℃温育1小时；(4)洗涤：弃去孔内液体，PBST液洗涤4遍，扣干；(5)显色：分别向空白对照组、阴性对照组和阳性对照组、待测血清的每孔加底物A液、底物B液各50μl，轻拍混匀，置37℃温育10分钟；(6)加入终止液50μl，轻拍混匀；(7)测定：酶标仪以空白对照孔调零，在波长450nm处测定各孔OD450值，打印测定结果；作为本专利技术的一种优选技术方案：包被稀释液由PBS、NaCl、KCl、Na2HPO4·12H2O、KH2PO4双蒸水组成，0.01mol/LPBS，NaCl8.0g、KCl0.2g、Na2HPO4·12H2O3.58g，KH2PO40.2g，加本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于MIX抗原包被的HCV NS3抗体酶免疫法检测方法，其特征在于，(1)包被:分别将HCV NS3(1型和6型)MIX抗原用0.01mol/LPBS(pH 7.2)稀释后包被微孔板，100μl/孔，放置4℃冰箱过夜，次日用1×PBST液洗涤3次，扣干密封，4℃储存备用；(2)加样：将稀释的酶标二抗(羊抗人‑IgG)加入酶标孔，100μl/孔，再依次加入1μl血清标本，分为空白对照组、阴性对照组和阳性对照组、待测血清，轻拍混匀；(3)温育：置37℃温育1小时；(4)洗涤：弃去孔内液体，PBST液洗涤4遍，扣干；(5)显色：分别向空白对照组、阴性对照组和阳性对照组、待测血清的每孔加底物A液、底物B液各50μl，轻拍混匀，置37℃温育10分钟；(6)加入终止液50μl，轻拍混匀；(7)测定：酶标仪以空白对照孔调零，在波长450nm处测定各孔OD450值，打印测定结果；(8)结果判定标准：采用比率表示法：用测定标本孔的OD450与阴性标本测定孔OD450(当阴性标本测定孔OD450

【技术特征摘要】
1.一种基于MIX抗原包被的HCVNS3抗体酶免疫法检测方法，其特征在于，(1)包被:分别将HCVNS3(1型和6型)MIX抗原用0.01mol/LPBS(pH7.2)稀释后包被微孔板，100μl/孔，放置4℃冰箱过夜，次日用1×PBST液洗涤3次，扣干密封，4℃储存备用；(2)加样：将稀释的酶标二抗(羊抗人-IgG)加入酶标孔，100μl/孔，再依次加入1μl血清标本，分为空白对照组、阴性对照组和阳性对照组、待测血清，轻拍混匀；(3)温育：置37℃温育1小时；(4)洗涤：弃去孔内液体，PBST液洗涤4遍，扣干；(5)显色：分别向空白对照组、阴性对照组和阳性对照组、待测血清的每孔加底物A液、底物B液各50μl，轻拍混匀，置37℃温育10分钟；(6)加入终止液50μl，轻拍混匀；(7)测定：酶标仪以空白对照孔调零，在波长450nm处测定各孔OD450值，打印测定结果；(8)结果判定标准：采用比率表示法：用测定标本孔的OD450与阴性标本测定孔OD450(当阴性标本测定孔OD450<0.06时以0.06计)的比值(P/N)表示，当P/N>2.1时判为阳性，否则为阴性。2.根据权利要求1所述的一种基于MIX抗原包被的HCVNS3抗体酶免疫法检测方法，其特征在于：包被稀释液由PBS、NaCl、KCl、Na2HPO4·12H2O、KH2PO4双蒸水组成，0.01mol/LPBS，NaCl8.0g、KCl0.2g、Na2HPO4·12H2O3.58g，KH2PO40.2g，加双蒸水至1L，调pH至7.2。3.根据权利要求1所述的一种基于MIX抗原包被的HCVNS3抗体酶免疫法检测方法，其特征在于：碳酸盐缓冲液由Na2CO3、NaHCO3、Na2N3、双蒸水组成，Na2CO31.5g、NaHCO32.9g、Na2N30.2g加双蒸水至1000ml调至pH9.6。4.根据权利要求1所述的一种基于MIX抗原包...

【专利技术属性】
技术研发人员：乔伟振，李另另，乔简，
申请(专利权)人：无锡市人民医院，
类型：发明
国别省市：江苏,32