使用患者来源的细胞筛选抗体的方法技术

本公开文本涉及通过使用患者来源的肿瘤球体筛选抗体或其抗原结合片段的方法，并且更具体地涉及通过使用含有抗原的患者来源的肿瘤球体来筛选与该抗原特异性地结合的抗体或其抗原结合片段的方法。

Screening of antibodies using patient-derived cells

The present disclosure relates to a method of screening antibodies or antigen-binding fragments by using patient-derived tumor spheres, and more specifically to a method of screening antibodies or antigen-binding fragments specifically bound to the antigen by using patient-derived tumor spheres containing antigens.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使用患者来源的细胞筛选抗体的方法
公开文本涉及通过使用患者来源的肿瘤球体筛选抗体或其抗原结合片段的方法，并且更具体地涉及通过使用含有抗原的患者来源的肿瘤球体来筛选与该抗原特异性地结合的抗体或其抗原结合片段的方法。
技术介绍
抗体药物由于其高疗效和靶向治疗特性而在生物制药领域中增长最快。抗生素药物市场是200种生物制药中增长最快的领域，占生物制药市场总量的比例很高(37％)，抗体药物的全球市场预计在2012年以11.8％的年均增长率(为515亿美元)增长，在2017年达到899亿美元(2013BiopharmaceuticsTrendReport,theKoreanMinistryofTrade,IndustryandEnergy,2013)。作为抗体药物主要靶标的疾病主要集中在特定的疾病，如难治性癌症(49％)和免疫疾病(35％)，因此在具有相似适应症的产品之间的市场竞争非常激烈。然而，在疾病中存在细分的治疗靶标，因此用于抗癌疗法的抗体治疗药物的开发领域肯定会在未来继续增长。用于鉴定和获得作为这些抗体药物的主要活性成分的抗体候选物的技术可大体上分为：使用杂交瘤细胞系开发嵌合或人源化抗体、使用转基因小鼠的方法和使用抗体展示技术的方法。1975年，开发了一种杂交瘤技术，该技术使用通过将癌细胞与正常细胞融合而形成的杂交细胞来产生单克隆抗体。从那时起，已经开始抗体药物的积极开发，并且已经开发了鉴定人源化抗体和人抗体的技术，以便解决当给人应用小鼠单克隆抗体时发生的HAMA(人抗小鼠抗体)反应。可以通过转基因小鼠和抗体展示技术(噬菌体展示、酵母展示、核糖体展示等)来举例说明用于产生人抗体的
使用近来最常尝试的转基因小鼠进行抗体开发是这样的技术，该技术通过将现有的杂交瘤技术应用于移植有人抗体基因的转基因小鼠来产生人单克隆抗体。该技术具有很大的优势，因为它可以由于可能的体内成熟而产生高亲和力抗体，并且可以有效产生人抗体。然而，其缺点在于，转基因小鼠的使用条件昂贵，并且在技术门槛如生产工艺方面是困难的。在抗体展示技术中，噬菌体展示技术是通过在噬菌体表面上展示抗体片段来筛选抗体的技术，并且基于M13PⅢ噬菌体的展示技术是最广泛使用的。然而，由于通过基因重组表达的抗体片段显示在噬菌体的表面上，这些噬菌体显示技术难以筛选细胞表面蛋白(如G蛋白受体)或难以重组表达的抗体。为了解决这些问题，已经开发了在筛选步骤中不使用重组蛋白的策略，其为使用细胞表面蛋白自身进行筛选的策略。在常规的引证参考文献中已经发现，可以通过将抗体候选物与细胞一起孵育来筛选与细胞表面上表达的抗原直接结合的抗体或肽(AndersenPS等人，ProcNatlAcadSciUSA93:1820–1824,1996；BarryMA等人，NatMed2:299–305,1995；CaiX,GarenA.ProcNatlAcadSciUSA92:6537–6541,1995)。然而，上述基于细胞的展示方法的缺点在于，由于使用在实验室中培养的细胞进行筛选，当通过该方法筛选的抗体实际应用于患者时不能适当地发挥其作用。同时，通过接头将细胞毒性药物与抗体缀合，获得抗体-药物缀合物(ADC)。由于单克隆抗体显示出靶特异性，因此可以将抗体-药物缀合物的药物递送至表达抗原/靶标的肿瘤，该抗原/靶标被具有选择性靶向能力的单克隆抗体识别。理想的是，在给予后在血液中保持前药状态的抗体-药物缀合物不应该是有毒的，并且由于抗体在与其靶肿瘤抗原结合后被内化到癌细胞中，药物以活性形式释放并杀死肿瘤细胞。因此，确定抗体所结合的靶标/抗原是构建抗体-药物缀合物的重要起点。特别地，抗体所结合的靶标/抗原已成为肿瘤细胞中主要表达(过表达)的细胞表面蛋白。在人癌细胞表面上表达的抗原的定义是指相对于正常组织被过表达或突变和选择性表达的范围广泛的靶标。关键问题是针对基于抗体的疗法来鉴定适当的抗原。这些治疗剂介导抗原或受体功能的变化(即，作为刺激剂或拮抗剂起作用)，通过Fc和T细胞活化调节免疫系统，并通过递送与靶向特定抗原的抗体结合的特定药物发挥其功效。已出现可以改变抗体药代动力学、功能、大小和免疫刺激性质的分子技术，作为开发基于抗体的新疗法的关键要素。从治疗性抗体在癌症患者上的临床试验中获得的证据强调了关于靶抗原和抗体之间的亲和力和结合能力、抗体结构的选择和优化抗体的选择的方法(包括治疗方法(信号传导抑制或免疫功能))的重要性。因此，诸位专利技术人已经进行了广泛的努力来开发能够筛选对患者高度有效的抗体的方法，并且结果是已发现当使用含有抗原的患者来源的肿瘤球体筛选抗体库时，可以筛选出具有高灵敏性和准确性且导致较少副作用的抗体，由此完成本公开文本。
技术实现思路
技术问题本公开文本的目的是提供使用过表达抗原的患者来源的肿瘤球体来筛选抗体的方法。本公开文本的另一个目的是提供使用过表达抗原的患者来源的肿瘤球体和包含该肿瘤球体的动物模型来筛选抗体的方法。本公开文本的又另一个目的是提供通过该方法筛选的抗体或其抗原结合片段。本公开文本的又另一个目的是提供用于预防或治疗癌症的组合物，其包含作为活性成分的通过该方法筛选的抗体或其抗原结合片段。技术方案为实现以上目的，本公开文本提供了筛选与抗原结合的抗体或其抗原结合片段的方法，该方法包括以下步骤：(i)用包含抗体或其抗原结合片段的文库处理表达抗原的患者来源的肿瘤球体，并筛选与该抗原结合的抗体或其抗原结合片段；(ii)将筛选的抗体或其抗原结合片段与不表达该抗原的患者来源的肿瘤球体一起孵育；并且(iii)从步骤(i)中筛选的抗体或其抗原结合片段中分离或去除与步骤(ii)的患者来源的肿瘤球体结合的抗体或其抗原结合片段。本公开文本还提供了筛选与抗原结合的抗体或其抗原结合片段的方法，该方法包括以下步骤：(i)用包含抗体或其抗原结合片段的文库处理表达该抗原的患者来源的肿瘤球体，并且进行与该抗原结合的抗体或其抗原结合片段的第一次筛选；(ii)用第一次筛选的抗体或其抗原结合片段处理不表达该抗原的患者来源的肿瘤球体；(iii)向移植有表达该抗原的患者来源的肿瘤球体的动物模型给予通过从步骤(i)中的抗体或其抗原结合片段分离或去除与步骤(ii)的患者来源的肿瘤球体结合的抗体或其抗原结合片段而获得的抗体或其抗原结合片段，并且对与该抗原结合的抗体或抗原结合片段进行第二次筛选；和(iv)从第二次筛选的抗体或其抗原结合片段中分离或去除与该抗原以外的抗原结合的抗体或其抗原结合片段。本公开文本还提供了通过该筛选方法筛选的抗体或其抗原结合片段。本公开文本还提供了包含抗体或其抗原结合片段的用于预防或治疗癌症的组合物。附图简述图1是显示本公开文本的方法的概念视图。图2示意性地显示了根据本公开文本的一个实施方案筛选与神经毡蛋白1(NRP1)抗原结合的抗体的方法。图3示意性地显示了体内筛选与NRP1抗原结合的抗体的方法。图4显示了根据本公开文本的一个实施方案的用于产生抗NRP1抗体片段的噬菌粒载体的构型。图5显示了根据本公开文本的一个实施例纯化的每个抗NRP1抗体片段的考马斯染色的结果。图6显示了指示针对NRP1的根据本公开文本的一个实施例筛选的三个抗NRP1抗体片段的结合亲和力的ELISA结果。图7显示了指本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种筛选与抗原结合的抗体或其抗原结合片段的方法，该方法包括以下步骤：(i)用包含抗体或其抗原结合片段的文库处理表达该抗原的患者来源的肿瘤球体，并且筛选与该抗原结合的抗体或其抗原结合片段；(ii)将筛选的抗体或其抗原结合片段与不表达该抗原的患者来源的肿瘤球体一起孵育；并且(iii)从步骤(i)中筛选的抗体或其抗原结合片段中分离或去除与步骤(ii)的患者来源的肿瘤球体结合的抗体或其抗原结合片段。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.06.03 KR 10-2016-00693551.一种筛选与抗原结合的抗体或其抗原结合片段的方法，该方法包括以下步骤：(i)用包含抗体或其抗原结合片段的文库处理表达该抗原的患者来源的肿瘤球体，并且筛选与该抗原结合的抗体或其抗原结合片段；(ii)将筛选的抗体或其抗原结合片段与不表达该抗原的患者来源的肿瘤球体一起孵育；并且(iii)从步骤(i)中筛选的抗体或其抗原结合片段中分离或去除与步骤(ii)的患者来源的肿瘤球体结合的抗体或其抗原结合片段。2.一种筛选与抗原结合的抗体或其抗原结合片段的方法，该方法包括以下步骤：(i)用包含抗体或其抗原结合片段的文库处理表达该抗原的患者来源的肿瘤球体，从而第一次筛选与该抗原结合的抗体或其抗原结合片段；(ii)用第一次筛选的抗体或其抗原结合片段处理不表达该抗原的患者来源的肿瘤球体；(iii)向移植有表达该抗原的患者来源的肿瘤球体的动物模型给予抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段是通过从步骤(i)中筛选的抗体或其抗原结合片段分离或去除与步骤(ii)的患者来源的肿瘤球...

【专利技术属性】
技术研发人员：南都铉，
申请(专利权)人：社会福祉法人三星生命公益财团，
类型：发明
国别省市：韩国,KR