抗NRP1抗体筛选方法技术

本公开文本涉及通过使用过表达NRP1的患者来源的肿瘤球体和包含该肿瘤球体的动物模型筛选抗NRP1抗体或其抗原结合片段的方法，并且更具体地涉及通过分别使用含有NRP1的患者来源的肿瘤球体和移植有该肿瘤球体的动物模型通过体外和体内淘选来筛选抗体或其抗原结合片段的方法。

Screening method of anti-NRP1 antibody

This open text relates to the screening of anti-NRP1 antibodies or their antigen binding fragments by using a patient-derived tumor sphere overexpressing NRP1 and an animal model containing the tumor sphere, and more specifically to the screening of antibodies or their antigens through in vitro and in vivo screening by using a patient-derived tumor sphere containing NRP1 and an animal model transplanted with the tumor sphere, respectively. The method of binding fragments.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】抗NRP1抗体筛选方法
本公开文本涉及通过使用过表达NRP1的患者来源的肿瘤球体和包含该肿瘤球体的动物模型筛选抗NRP1抗体或其抗原结合片段的方法，并且更具体地涉及通过分别使用含有NRP1的患者来源的肿瘤球体和移植有该肿瘤球体的动物模型通过体外和体内淘选来筛选抗体或其抗原结合片段的方法。
技术介绍
神经毡蛋白(NRP)包括首先在神经细胞中发现的NRP1和NRP2。已知NRP1由约923个氨基酸构成，NRP2由约926个氨基酸构成。此外，它们共同具有相似的结构域结构，并且因此具有总共44％的氨基酸同源性。神经毡蛋白(NRP)包括首先在神经细胞中发现的NRP1和NRP2。已知NRP1由约923个氨基酸构成，NRP2由约926个氨基酸构成。此外，NRP1和NRP2共同具有相似的结构域结构，并且因此具有总共44％的氨基酸同源性。已知NRP1是与臂板蛋白3A配体结合的受体，该臂板蛋白3A配体作用于丛蛋白辅助受体以调节轴突诱导。然后发现NRP1与血管内皮生长因子(VEGF)配体家族的成员结合，从而介导血管生成。通过血管系统的发育，出现众多的生理过程和病理过程。血液必然充分供应给诸如肿瘤的活跃生长的组织。这些组织通常产生促进新血管形成和维持的促血管生成因子，从而通过血管生成而供应血液。血管生成不是一个简单的过程，而是通过以下步骤完成的：a)内皮细胞(EC)从现有的内皮细胞增殖或分化；b)内皮细胞迁移并聚结形成索状结构；c)血管索进展为小管形成并且形成在中心具有管腔的血管；d)现有索或血管的芽开始形成二级血管；e)原始丛进一步再生长和再生；和f)内皮细胞被置于内皮管中以便为血管提供维持和调节功能(这些细胞包括在小毛细血管情况下的周细胞、在大血管情况下的平滑肌细胞以及在心脏中的心肌细胞)。已知NRP1在多种人肿瘤细胞系和人类肿瘤(比如胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、神经胶质瘤、神经母细胞瘤、睾丸癌、结肠直肠癌、黑素瘤、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、食道癌和前列腺癌)中表达。还已知NRP1参与VEGF和臂板蛋白对癌细胞的增殖、存活和转移的作用。此外，已知的是，根据NRP1表达的程度，癌症进展的程度增加或癌症患者的预后差。当肿瘤生长时，血管生成在从增生到瘤形成的转变中是至关重要的，并且可能在为肿瘤生长和转移提供营养物质中起关键作用。与正常细胞相比，新血管形成允许肿瘤细胞获得生长优势和增殖自主性。由于到可用的毛细血管层的距离的缘故，肿瘤通常以能在仅仅几立方毫米内增殖的单个异常细胞开始，并且能够长期处于停滞的“潜伏”状态，而没有进一步的生长和传播。随后，一些肿瘤细胞转化为血管生成表型，从而激活内皮细胞，并且增殖和成熟为新的毛细血管。这些新形成的血管不仅允许原发肿瘤连续生长，而且还能使转移性肿瘤细胞增殖和再定殖。在这方面，需要能够以高亲和力与NRP1结合并抑制癌细胞生长的抗NRP1抗体，以治疗其中NRP1过表达的癌症。抗体药物由于其高疗效和靶向治疗特性而在生物制药领域中增长最快。抗生素药物市场是200种生物制药中增长最快的领域，占生物制药市场总量的比例很高(37％)，抗体药物的全球市场预计在2012年以11.8％的年均增长率(为515亿美元)增长，在2017年达到899亿美元(2013BiopharmaceuticsTrendReport,theKoreanMinistryofTrade,IndustryandEnergy,2013)。作为抗体药物主要靶标的疾病主要集中在特定的疾病，如难治性癌症(49％)和免疫疾病(35％)，因此在具有相似适应症的产品之间的市场竞争非常激烈。然而，在疾病中存在细分的治疗靶标，因此用于抗癌疗法的抗体治疗药物的开发领域肯定会在未来继续增长。用于鉴定和获得作为这些抗体药物的主要活性成分的抗体候选物的技术可大体上分为：使用杂交瘤细胞系开发嵌合或人源化抗体、使用转基因小鼠的方法和使用抗体展示技术的方法。1975年，开发了一种杂交瘤技术，该技术使用通过将癌细胞与正常细胞融合而形成的杂交细胞来产生单克隆抗体。从那时起，已经开始抗体药物的积极开发，并且已经开发了鉴定人源化抗体和人抗体的技术，以便解决当给人应用小鼠单克隆抗体时发生的HAMA(人抗小鼠抗体)反应。可以通过转基因小鼠和抗体展示技术(噬菌体展示、酵母展示、核糖体展示等)来举例说明用于产生人抗体的
使用近来最常尝试的转基因小鼠进行抗体开发是这样的技术，该技术通过将现有的杂交瘤技术应用于移植有人抗体基因的转基因小鼠来产生人单克隆抗体。该技术具有很大的优势，因为它可以由于可能的体内成熟而产生高亲和力抗体，并且可以有效产生人抗体。然而，其缺点在于，转基因小鼠的使用条件昂贵，并且在技术门槛如生产工艺方面是困难的。在抗体展示技术中，噬菌体展示技术是通过在噬菌体表面上展示抗体片段来筛选抗体的技术，并且基于M13PⅢ噬菌体的展示技术是最广泛使用的。然而，由于通过基因重组表达的抗体片段显示在噬菌体的表面上，这些噬菌体显示技术难以筛选细胞表面蛋白(如G蛋白受体)或难以重组表达的抗体。为了解决这些问题，已经开发了在筛选步骤中不使用重组蛋白的策略，其为使用细胞表面蛋白自身进行筛选的策略。在常规的引证参考文献中已经发现，可以通过将抗体候选物与细胞一起孵育来筛选与细胞表面上表达的抗原直接结合的抗体或肽(AndersenPS等人，ProcNatlAcadSciUSA93:1820–1824,1996；BarryMA等人，NatMed2:299–305,1995；CaiX,GarenA.ProcNatlAcadSciUSA92:6537–6541,1995)。然而，上述基于细胞的展示方法的缺点在于，由于使用在实验室中培养的细胞进行筛选，当通过该方法筛选的抗体实际应用于患者时不能适当地发挥其作用。同时，通过接头将细胞毒性药物与抗体缀合，获得抗体-药物缀合物(ADC)。由于单克隆抗体显示出靶特异性，因此可以将抗体-药物缀合物的药物递送至表达抗原/靶标的肿瘤，该抗原/靶标被具有选择性靶向能力的单克隆抗体识别。理想的是，在给予后在血液中保持前药状态的抗体-药物缀合物不应该是有毒的，并且由于抗体在与其靶肿瘤抗原结合后被内化到癌细胞中，药物以活性形式释放并杀死肿瘤细胞。因此，确定抗体所结合的靶标/抗原是构建抗体-药物缀合物的重要起点。特别地，抗体所结合的靶标/抗原已成为肿瘤细胞中主要表达(过表达)的细胞表面蛋白。在人癌细胞表面上表达的抗原的定义是指相对于正常组织被过表达或突变和选择性表达的范围广泛的靶标。关键问题是针对基于抗体的疗法来鉴定适当的抗原。这些治疗剂介导抗原或受体功能的变化(即，作为刺激剂或拮抗剂起作用)，通过Fc和T细胞活化调节免疫系统，并通过递送与靶向特定抗原的抗体结合的特定药物发挥其功效。已出现可以改变抗体药代动力学、功能、大小和免疫刺激性质的分子技术，作为开发基于抗体的新疗法的关键要素。从治疗性抗体在癌症患者上的临床试验中获得的证据强调了关于靶抗原和抗体之间的亲和力和结合能力、抗体结构的选择和优化抗体的选择的方法(包括治疗方法(信号传导抑制或免疫功能))的重要性。在这些技术背景下，本申请的诸位专利技术人已经进行了广泛的努力来开发抗癌治疗性抗体，其与已知在各种癌症中表达的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种筛选与NRP1结合的抗体或其抗原结合片段的方法，该方法包括以下步骤：(i)用包含抗体或其抗原结合片段的文库处理表达NRP1的患者来源的肿瘤球体，以筛选与NRP1结合的抗体或其抗原结合片段；(ii)用其中不表达NRP1的患者来源的肿瘤球体处理筛选的抗体或其抗原结合片段；并且(iii)从步骤(i)中筛选的抗体或其抗原结合片段中分离或去除与步骤(ii)的患者来源的肿瘤球体结合的抗体或其抗原结合片段。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.06.03 KR 10-2016-00693601.一种筛选与NRP1结合的抗体或其抗原结合片段的方法，该方法包括以下步骤：(i)用包含抗体或其抗原结合片段的文库处理表达NRP1的患者来源的肿瘤球体，以筛选与NRP1结合的抗体或其抗原结合片段；(ii)用其中不表达NRP1的患者来源的肿瘤球体处理筛选的抗体或其抗原结合片段；并且(iii)从步骤(i)中筛选的抗体或其抗原结合片段中分离或去除与步骤(ii)的患者来源的肿瘤球体结合的抗体或其抗原结合片段。2.一种筛选与NRP1结合的抗体或其抗原结合片段的方法，该方法包括以下步骤：(i)用包含抗体或其抗原结合片段的文库处理表达NRP1的患者来源的肿瘤球体，从而第一次筛选与NRP1结合的抗体或其抗原结合片段；(ii)用第一次筛选的抗体或其抗原结合片段处理不表达NRP1的患者来源的肿瘤球体；(iii)向移植有过表达NRP1的患者来源的肿瘤球体的动物模型给予抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段是通过从步骤(i)中筛选的抗体或其抗原结合片段分离/去除与步骤(ii)的患者来源的肿瘤球体结合的抗...

【专利技术属性】
技术研发人员：南都铉，李在铉，
申请(专利权)人：社会福祉法人三星生命公益财团，
类型：发明
国别省市：韩国,KR