一种化学发光法快速检测水通道蛋白1的试剂盒制造技术

本发明专利技术目的于提供一种基于化学发光法快速检测水通道蛋白1的试剂盒，用于检测人体尿液样本中水通道蛋白1作为辅助诊断用。一种人水通道蛋白1化学发光法试剂盒，包括样本处理液、酶标液、包被有捕获抗体的固相载体、发光底物其特征在于：所述的捕获抗体为抗人水通道蛋白1多克隆抗体；所述的酶标液，主要成份为酶标记抗人水通道蛋白1单克隆抗体。

A Kit for Rapid Detection of Aquaporin 1 by Chemiluminescence

The aim of the present invention is to provide a kit for rapid detection of aquaporin 1 based on chemiluminescence method, which can be used to detect aquaporin 1 in human urine samples for auxiliary diagnosis. A chemiluminescence kit for human aquaporin-1 includes sample treatment solution, enzyme labeling solution, solid-phase carrier coated with captured antibody, and light-emitting substrate. The captured antibody is a polyclonal antibody against human aquaporin-1, and the enzyme labeling solution is mainly composed of an enzyme-labeled monoclonal antibody against human aquaporin-1.

【技术实现步骤摘要】
一种化学发光法快速检测水通道蛋白1的试剂盒
本专利技术属于生物医药技术化学发光法检测领域，具体地说涉及一种基于化学发光的检测人水通道蛋白1的检测试剂盒。
技术介绍
肾细胞癌(简称肾癌)是泌尿系统中恶性度较高的肿瘤，也是最常见的肿瘤之一，是起源于肾实质泌尿小管上皮系统的恶性肿瘤，又称肾腺癌，占肾恶性肿瘤的80％～90％。据调查，肾癌在我国泌尿生殖系统肿瘤中占第二位，仅次于膀胱肿瘤，占成人恶性肿瘤的2％～3％、小儿恶性肿瘤的20％左右，近年来发病率依然稳定上升。目前研究表明，在肾癌初期肿块较小时发现治疗5年生存率85％，中晚期肿块较大时发现治疗5年生存率下降到62％，节结转移后5年生存率进一步降至20％。由此可见早期发现对于提高患者生存率有重要意义，对于改善肾癌患者预后显得尤为重要。迄今为止，肾癌诊断早期一般采用B超，CT，X光造影等能对于1cm以上发现诊断，对于过小肿块难以区分，现有研究表明尿液中水通道蛋白1(Aquaporin，AQP1)和围脂滴蛋白2(perilipin-2，PLIN2，ADFP)浓度与透明肾细胞癌、乳头状肾细胞癌患者较高相关，浓度与肿瘤大小和阶段相关，对于诊疗有重大的意义，本领域迫切需要提供一种在临床中能够快速准确地检测水通道蛋白1和围脂滴蛋白2的方法，以满足临床的需要。
技术实现思路
本专利技术目的于提供一种基于化学发光法快速检测水通道蛋白1的试剂盒，用于检测人体尿液样本中水通道蛋白1作为辅助诊断用。为了达到上述目的，本专利技术采用了以下技术步骤：一种人水通道蛋白1化学发光法试剂盒，包括样本处理液、含有酶标记抗人水通道蛋白1单克隆抗体酶标液、包被有抗人水通道蛋白1多克隆抗体的固相载体、发光底物。所述的抗人水通道蛋白1单克隆抗体，可以通过使用人水通道蛋白1作为免疫原免疫动物制得，优选鼠源或兔源。所述的抗人水通道蛋白1多克隆抗体，可以通过使用人水通道蛋白1作为免疫原免疫动物制得，优选鼠源、马源、羊源、兔、或豚鼠源。前述的作为免疫原的人水通道蛋白1可以通过基因工真核表达克隆化基因获得的重组人水通道蛋白1，也可以使用培养人肾近曲小管细胞纯化获得人水通道蛋白1。培养人肾近曲小管细胞纯化获得人水通道蛋白1，可以是人水通道蛋白1完整四聚体，也可以经过水解成的四个单体任意之一或组合。所述的酶标液中的酶标可以直接使用辣根过氧化物歧化酶标记前述抗人水通道蛋白1单克隆抗体，也可以使用亲和素标记辣根过氧化物歧化酶与生物素标记抗人水通道蛋白1单克隆抗体单抗结合形成的偶联物，使用辣根过氧化物歧化酶-亲和素-生物素-抗人水通道蛋白1单克隆抗体偶联物时可以提高酶的浓度，扩大整个发光反应的放大倍数，反应强度，加快反应速度。所述的样本处理液，可以使用PBS，PBST，CB，Tris，EDTA，TE等本领域技术人员常用的pH6～10缓冲液，也可以直接不经样本处理液直接使用样本，直接使用样本时会存在较高的检测本底使用pH6.0～10.0的缓冲液可以有效降低检测本底值，使用pH9.6的CB缓冲液时，检测信噪比明显高于pH6.0～8.0缓冲液，样本处理液优选pH9.4～pH10.0。为了更好户确缓冲液位于最适合的pH值加入酸碱指示剂，本专利技术中优选百里酚酞。所述的固相载体可以使用酶标板、聚苯乙烯微球、磁性微球等本
常用免疫吸附固相材料。所述的发光底物可以采用商品化的发光底物，也可以使用鲁米诺或其经过修饰后的化合物作为还原剂与双氧水、过氧化脲等辣根过氧化物歧化酶敏感的过氧化剂，还原剂与氧化剂可以在同一组份中或独立分装，独立分装可以提高发光底物长期稳定性。具体实施方式实施例1：抗水通道蛋白1抗体制备培养人肾近曲小管细胞，经过裂解后纯化获得天然水通道蛋白1的4聚体片段，作为免疫原1；对天然水通道蛋白1的4聚体片段使用胰酶水解后分离获得天然水通道蛋白1单体作为免疫原2；通过基因重组真核表达克隆化基因获得的人水通道蛋白1，作为免疫原3，分别使用三种免疫原加弗氏完全佐剂免疫小鼠，经过三次增强免疫，提取血清测定目标抗体效价，经过琼脂扩散效价达1∶16后处死小鼠后采集全部血清，对所采集的血清进行纯化获得多克隆抗体，同时取脾脏制备脾细胞悬液，取小鼠骨髓瘤细胞与脾细胞悬液混合后加入聚乙二醇，融合后经选择性培养获得杂交瘤细胞，筛选分泌特异性抗体杂交瘤细胞经增殖后接种于小鼠腹腔，经过2周左右采集小鼠腹水纯化获得单克隆抗体。所有获得的多克隆抗体与单克隆抗体都同原免疫原经扩散法呈阳性反应。多克隆抗体效价优于单克隆抗体，免疫原1来源产生的多克隆抗体与单克隆抗体效价优于免疫原2产生的多克隆抗体与单克隆抗体。经过蛋白质免疫印迹验证，免疫原1来源的多克隆抗体杂条带多于免疫原2产生的多克隆抗体。实施例2：一种人水通道蛋白1化学发光法试剂盒，包括样本处理液、酶标液、包被有捕获抗体的固相载体、发光底物、标准品。样本处理液成分：pH9.4～10.0的CB，含0.1％百里酚酞。酶标液主要成分：辣根过氧化物歧化酶兔抗重组人水通道蛋白1抗体。包被有捕获抗体的固相载体：包被鼠抗重组人水通道蛋白1多克隆抗体的磁性微球。发光底物：A液为鲁米诺含量为0.02M，pH＝8.0的TE溶液，B液为每100mL溶液含柠檬酸0.282g，0.2g过氧化脲的pH＝8.0的TE溶液。经过对10份患者与100份健康人志愿者尿液进行检测，以志愿者检测均值加上3标准差，患者阳性率80％，健康人血清阴性率100％。对1份200ng/ml以上的阳性样本进行1∶10，1∶100，1∶1000，1∶10000，1∶100000，5个梯度进行稀释，经检测发光强度与浓度呈正相关，拟合对数曲线，R＞0.9。实施例3：一种人水通道蛋白1化学发光法试剂盒，包括样本处理液、酶标液、包被有捕获抗体的固相载体、发光底物。样本处理液成分：pH7.4的PBS。酶标液主要成分：亲和素标记辣根过氧化物歧化酶与生物素标记抗人水通道蛋白1单克隆抗体单抗结合形成的偶联物。包被有捕获抗体的固相载体：包被鼠抗重组人水通道蛋白1抗体的酶标板。发光底物：A液为鲁米诺含量为0.02M，pH＝8.0的TE溶液，B液为每100mL溶液含柠檬酸0.282g，0.2g过氧化脲的pH＝8.0的TE溶液。经过对10份患者与100份健康人志愿者尿液进行检测，以志愿者检测均值加上3标准差，患者阳性率50％，健康人血清阴性率98％。对1份200ng/ml以上的阳性样本进行1∶10，1∶100，1∶1000，1∶10000，1∶100000，5个梯度进行稀释，经检测发光强度与浓度呈正相关，拟合对数曲线，R＞0.9。实施例4：一种人水通道蛋白1化学发光法试剂盒，包括样本处理液、酶标液、包被有捕获抗体的固相载体、发光底物、标准品。样本处理液成分：pH9.4～10.0的CB，含0.1％百里酚酞。酶标液主要成分：亲和素标记辣根过氧化物歧化酶与生物素标记抗重组人水通道蛋白1单克隆抗体单抗结合形成的偶联物。包被有捕获抗体的固相载体：包被鼠抗重组人水通道蛋白1多克隆抗体的磁性微球。发光底物：A液为鲁米诺含量为0.02M，pH＝8.0的TE溶液，B液为每100mL溶液含柠檬酸0.282g，0.2g过氧化脲pH＝8.0的TE溶液。标准品：三份含重组人水通道蛋白1抗体浓度分别为2ng本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种人水通道蛋白1化学发光法试剂盒，包括样本处理液、酶标液、包被有捕获抗体的固相载体、发光底物其特征在于：所述的捕获抗体为抗人水通道蛋白1多克隆抗体；所述的酶标液，主要成份为酶标记抗人水通道蛋白1单克隆抗体。

【技术特征摘要】
1.一种人水通道蛋白1化学发光法试剂盒，包括样本处理液、酶标液、包被有捕获抗体的固相载体、发光底物其特征在于：所述的捕获抗体为抗人水通道蛋白1多克隆抗体；所述的酶标液，主要成份为酶标记抗人水通道蛋白1单克隆抗体。2.根据要利要求1所述的人水通道蛋白1化学发光法试剂盒，其特征在于：所述抗人水通道蛋白1抗体的免疫原为纯化人肾近曲小管细胞来源水通道蛋白1。3.根据要利要求2所述的人水通道蛋白1化学发光法试剂盒，其特征在于：所述纯化人肾近曲小管细胞来源水通道蛋白1为纯化人肾近曲小管细胞来源水通道蛋白1四聚体。4.根据要利要求1所述的人水通道蛋白1化学发光法试剂盒，其特征在于：所述抗人水通道蛋白1抗体的免疫原为能过真核表达克隆化基因获得的人水通道蛋白1。5.根据权利要求2至4所述的人水通道蛋白1化学发光法试剂盒，其特征在于：所述抗人水通道蛋白1多克隆抗体，为鼠源、马源、羊源、兔、或豚鼠源中的一种；所述的抗人水通道蛋白1单克隆抗体为鼠源或兔源中的一种。...

【专利技术属性】
技术研发人员：顾悦，戴薇薇，徐长银，
申请(专利权)人：迪亚莱博张家港生物科技有限公司，上海费玛生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32