多巴胺发光免疫检测试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种多巴胺发光免疫检测试剂盒，包括检测系统和样本前处理系统；其中的检测系统包括直接或间接包被有多巴胺抗体的固相载体，多巴胺抗体溶液，亲和素连接示踪物溶液和校准品；样本前处理系统包括富集材料，酰化剂，甲基化酶。本发明专利技术的优点在于克服了现有多巴胺检测方法的缺点与不足，先对尿液或血浆中多巴胺富集、酰化以及甲基化前处理，利用顺式二醇特异性亲和介质吸附分离多巴胺，采取一端为生物素的酰化剂酰化方案，使酰化以及甲基化后的多巴胺被抗体识别并反应后，结合示踪标记物连接的亲和素的方法，准确地测定样本中的多巴胺含量。本发明专利技术试剂盒灵敏度和精密度高，利用发光技术实现检测的自动化，助力嗜铬细胞瘤临床诊断。

Dopamine Luminescent Immunoassay Kit

The invention discloses a dopamine Luminescent Immunoassay kit, which comprises a detection system and a sample pretreatment system. The detection system includes a solid carrier directly or indirectly coated with dopamine antibody, a dopamine antibody solution, an avidin-linked tracer solution and a calibration product. The sample pretreatment system includes enrichment material, acylating agent and methylase. The advantages of the present invention are to overcome the shortcomings and shortcomings of the existing dopamine detection methods. Firstly, dopamine is enriched, acylated and pre-methylated in urine or plasma, dopamine is adsorbed and separated by cis-diol specific affinity medium, and acylated by an acylating agent with biotin at one end, so that the acylated and methylated dopamine are recognized and reacted by antibodies, and then combined and displayed. The method of tracer-linked avidin can accurately determine the content of dopamine in samples. The kit of the invention has high sensitivity and precision, realizes the automation of detection by using luminescence technology, and assists the clinical diagnosis of pheochromocytoma.

【技术实现步骤摘要】
多巴胺发光免疫检测试剂盒
本专利技术涉及生物检测技术，尤其是涉及一种多巴胺发光免疫检测试剂盒。
技术介绍
多巴胺(dopamine)是去甲肾上腺素的前体物质，是下丘脑和和脑垂体腺中的一种关键的神经递质，可以直接影响人们的情绪。多巴胺和肾上腺素、去甲肾上腺素和具有相似的化学结构，都是由一个含两个相邻羟基的苯环(儿茶酚核)和一个含氨基的侧链组成的化合物。因此，它们具有相似的理化特性。在肾上腺肿瘤患者中，0.5%～1%是嗜铬细胞瘤的患者，嗜铬瘤细胞持续或间断地大量释放儿茶酚胺类物质，故临床主要有儿茶酚胺过高的症状，引起持续性或阵发性的高血压和多个器官的功能及代谢紊乱，患者可出现头疼、心悸、多汗三联征及高血压等症状，特别严重者可并发急性左心衰竭或脑血管意外。本病还可以发生低血压，甚至休克，或出现高血压和低血压相交替的表现。目前，检测血浆中的儿茶酚胺类是诊断嗜铬细胞瘤常规的实验室手段。临床上，较常进行的相关检查指标包括肾上腺素和去甲肾上腺素，以及多巴胺和儿茶酚胺的代谢产物香草扁桃酸等。目前多巴胺的市场主流检测方法主要包括高效液相色谱法（HPLC）、酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定，但HPLC耗时比较久、成本高且较难实现批量测定，而酶联免疫测定法缺乏准确性和再现性。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种利用发光法对尿液中多巴胺含量进行检测的试剂盒，以期对嗜铬细胞瘤的及时诊断和治疗提供帮助。为实现上述目的，本专利技术可采取下述技术方案：本专利技术所述的多巴胺发光免疫检测试剂盒，包括检测系统和样本前处理系统；其中：所述的检测系统包括直接或间接包被有多巴胺抗体的固相载体，多巴胺抗体溶液，亲和素连接示踪物溶液和校准品；所述样本前处理系统包括富集材料，酰化剂，甲基化酶。所述示踪物为金刚烷、吖啶酯、鲁米诺及其衍生物、异鲁米诺及其衍生物、碱性磷酸酶（ALP）或辣根过氧化物酶（HRP）中的至少一种。所述亲和素为重组或天然纯化的亲和素，其使用浓度为1/1000～1/20000，其缓冲液中包含1～50g/L的BSA或其它蛋白如Casein，鱼明胶等。所述多巴胺抗体为抗多巴胺单克隆抗体或抗多巴胺多克隆抗体，所述固相包被的载体材料为磁性微球，也可以为透明或不透明微孔板。所述磁性微球的直径为0.1-8μm，表面连接有一种或多种活性功能基团，包括但不限于-COOH、-NH2、-OH，具有在外加磁场作用下可迅速被磁化，在撤走磁场后剩磁为零的属性；所述多巴胺抗体可以通过直接或间接包被的方法包被于磁性微球上，也可以以抗体溶液的形式在反应中连接于磁性微球上。所述间接包被磁性微球为通过FITC或抗FITC抗体或通过第二抗体进行间接包被。所述校准品为多巴胺抗原浓度从低到高范围在0ng/mL～12000ng/mL之间的多个不同浓度点的系列校准品，其缓冲液中包含有1～50g/L的牛血清白蛋白和防腐剂。所述富集材料为顺式二醇特异性亲和介质，包括硼酸亲和凝胶磁珠、硼酸亲和凝胶板、硼酸亲和凝胶管。所述酰化剂为一端生物素化的酰化剂，包括但不限于6-(马来酰亚胺基)己酸琥珀酰亚胺酯、N-[6-(生物素氨基)己酰基]-6-氨基己酸N-琥珀酰亚胺酯或N-琥珀酰亚氨基6-生物素氨己酸等，使用浓度为0.3～10mg/mL，缓冲液为磷酸、硼酸、碳酸盐缓冲体系。所述甲基化酶包括但不限于儿茶酚-O-甲基转移酶（COMT）、苯乙醇胺-N-甲基转移酶（PNMT）等，使用浓度为0.5mg/mL～1mg/mL；本专利技术所用的甲基供体包括但不限于S-腺苷甲硫氨酸（SAM）、甲硫氨酸（MET）、三甲基乙醇胺、三甲氨基己内酯等。使用浓度0.05～1mg/mL。所述的缓冲液为PBS、Tris-NaCL、Tris-HCL中的任一种，pH=5.0～10.0。本专利技术试剂盒的使用方法为：1、首先对样本进行前处理：尿液或血浆样本加入顺式二醇特异性亲和介质中，经吸附、提取后，加入酰化试剂，混匀反应10～50min，然后洗去未反应酰化试剂，将吸附于顺式二醇亲和介质上的多巴胺洗脱释放0.5～2h，之后加入甲基化酶溶液10～100μl，反应0.5～2h，将处理后的样本转移至反应杯，使用AutoLumo全自动检测分析仪进行检测。检测：2.1多巴胺抗体或FITC-多巴胺抗体以抗体溶液形式存在，磁微粒上连接有可与多巴胺抗体反应的第二抗体或FITC抗体，具体加样步骤为：a、处理后校准品和样本10～100μl分别加入不同的反应孔中；b、加入10～50μl磁微粒悬浮液，10～100μl的抗体溶液；c、37℃温育15～30min，置于磁环境下清洗5次；d、加入50～200μl标记有示踪物的亲和素溶液；e、37℃温育15～30min，置于磁环境下清洗5次；f、加入发光底物，检测光信号强度；g、通过校准品反应曲线，根据样本检测光强度计算出待测样本的多巴胺含量。2.2多巴胺以直接或间接方式连接于磁微粒，具体加样步骤为：a、处理后校准品和样本10～200μl分别加入不同的反应孔中；b、加入10～50μl磁微粒悬浮液；c、37℃温育15～30min，置于磁环境下清洗5次；d、加入50～200μl标记有示踪物的亲和素溶液；e、37℃温育15～30min，置于磁环境下清洗5次；f、加入发光底物，检测光信号强度；g、通过校准品反应曲线，根据样本检测光强度计算出待测样本的多巴胺含量。本专利技术采用六点定标法，首先取6个不同浓度梯度的多巴胺校准品，复孔测定不同浓度梯度的校准品的发光值，求均值，分别以浓度值为X轴，发光值的Log值为Y轴，根据（Lin-Log）四参数方法进行曲线拟合。使用上述试剂盒检测多巴胺浓度的方法包括采用全自动化学发光免疫分析仪，所用的化学发光免疫分析仪优选为AutoLumo全自动检测分析仪（郑州安图生物工程股份有限公司）。本专利技术的优点在于克服了现有多巴胺检测方法的缺点与不足，先对尿液或血浆中多巴胺富集、酰化以及甲基化前处理，利用顺式二醇特异性亲和介质吸附分离多巴胺，采取一端为生物素的酰化剂酰化方案，使酰化以及甲基化后的多巴胺被抗体识别并反应后，结合示踪标记物连接的亲和素的方法，准确地测定样本中的多巴胺含量。本专利技术试剂盒灵敏度和精密度高，利用发光技术实现检测的自动化，助力嗜铬细胞瘤临床诊断。附图说明图1是本专利技术试剂盒与HPLC的相关性图示。具体实施方式下面通过具体实施例对本专利技术做更加详细的说明，以便于本领域技术人员的理解。本专利技术实施例中所用的多巴胺抗体、第二抗体、亲和素标记示踪物（HRP、ALP、鲁米诺及其衍生物、异鲁米诺及其衍生物、金刚烷）均来源于郑州伊美诺生物技术有限公司。本专利技术试剂盒中未详细提及的试剂组分（例如清洗液等一些必要的缓冲液等）、试剂盒外包装以及各试剂组分的独立包装容器等均可以按照所属领域的常规操作进行，符合相关行业规定即可。本专利技术试剂盒的方法中未详细提及的操作步骤也可参照所属领域的常规操作进行。实施例1制备多巴胺发光免疫检测试剂盒1、制备固相载体材料磁性微球混悬液的制备：首先将选用的磁性微球原液经过10倍原液体积的PBS缓冲液冲洗2～5遍后使用EDC、NHS或戊二醛进行活化，活化后的磁性微球与浓度为5～40μg/mL的抗体通过化学连接任一方法进行包被，包被后的磁性微球经过清洗后使用封保液封闭后，定容并分装本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种多巴胺发光免疫检测试剂盒，其特征在于：包括检测系统和样本前处理系统；其中：所述的检测系统包括直接或间接包被有多巴胺抗体的固相载体，多巴胺抗体溶液，亲和素连接示踪物溶液和校准品；所述样本前处理系统包括富集材料，酰化剂，甲基化酶。

【技术特征摘要】
1.一种多巴胺发光免疫检测试剂盒，其特征在于：包括检测系统和样本前处理系统；其中：所述的检测系统包括直接或间接包被有多巴胺抗体的固相载体，多巴胺抗体溶液，亲和素连接示踪物溶液和校准品；所述样本前处理系统包括富集材料，酰化剂，甲基化酶。2.根据权利要求1所述的多巴胺发光免疫检测试剂盒，其特征在于：所述示踪物为金刚烷、吖啶酯、鲁米诺及其衍生物、异鲁米诺及其衍生物、碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶中的至少一种。3.根据权利要求1所述的多巴胺发光免疫检测试剂盒，其特征在于：所述亲和素为重组或天然纯化的亲和素，其使用浓度为1/1000～1/20000，其缓冲液中包含1～50g/L的BSA或其它蛋白。4.根据权利要求1所述的多巴胺发光免疫检测试剂盒，其特征在于：所述多巴胺抗体为单克隆或多克隆抗体，所述固相包被的载体材料为磁性微球或微孔板。5.根据权利要求1所述的多巴胺发光免疫检测试剂盒，其特征在于：所述磁性微球的直径为0.1-8μm，表面连接有一种或多种活性功能基团；所述多巴胺抗体可以通过直接或间接包被的方法包被于磁性微球上，也可以以抗体溶液的形式在反...

【专利技术属性】
技术研发人员：庄路阳，马雷，陈小玲，陈飞，杨敏，乔晓芳，李晓霞，付光宇，吴学炜，
申请(专利权)人：郑州安图生物工程股份有限公司，
类型：发明
国别省市：河南,41