用于形成人类神经元细胞和神经胶质细胞的功能网络的方法技术

本发明专利技术涉及一种用于形成人类神经元细胞和神经胶质细胞的功能网络的方法，其中将这些细胞引入到具有成分聚乙二醇(PEG)和肝素的合成水凝胶体系并在其中培养，其中这些细胞预先已经与这些凝胶成分之一、即PEG或肝素混合并且与之一起引入到PEG‑肝素水凝胶体系中，使得在形成该三维水凝胶期间这些细胞已经处于该水凝胶体系中。

A Method for Forming Functional Networks of Human Neuronal Cells and Glial Cells

The invention relates to a method for forming functional networks of human neuron cells and glial cells, wherein these cells are introduced into a synthetic hydrogel system consisting of polyethylene glycol (PEG) and heparin and cultured therein, wherein these cells are mixed with one of these gel components, namely PEG or heparin, and are introduced into PEG hydrogels. In this system, these cells were already in the hydrogel system during the formation of the three-dimensional hydrogel.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于形成人类神经元细胞和神经胶质细胞的功能网络的方法
本专利技术涉及一种用于形成人类神经元细胞和神经胶质细胞的功能网络(以下也称为神经元网络)的方法。该方法可以用于监测神经元网络的形成且同时尤其用于对影响人脑中的神经元和/或神经元网络形成的疾病进行建模。
技术介绍
D.Y.Kim等人Athree-dimensionalhumanneuralcellculturemodelofAlzheimer’sdisease，Nature2014，515，274-278的实际研究描述了以基因技术方式修饰嵌入到BDBiosciences公司的中的人类细胞，以便提供具有不大于0.3mm的总轴向平面的三维薄层结构。分化的神经元在4至12周中是有生命力的并且起作用的。在DawaiZhang等人，A3DAlzheimer’sdiseaseculturemodelandtheinductionofP21-activatedkinasemediatedsensinginiPSCderivedneurons，Biomaterials2014Feb；35(5)，1420-1428的类似研究中报道了由人类的诱导性多功能干细胞(iPSC)衍生的神经上皮干细胞(It-NES)系AF22及其在神经元系中的分化的用途。此外，使用了水凝胶，该水凝胶由BDBiosciences公司的制造并且用10μg/mL层粘连蛋白改性。这种培养体系基于通过自组装的精氨酸-丙氨酸-天冬氨酸-丙氨酸(RADA-单字编码)多肽通过非共价相互作用而交联的水凝胶体系。由于相对较弱的非共价相互作用，只能有限地调节该水凝胶体系的机械特性并且也不存在对特异性酶敏感的裂解位。由于细胞在BD-中的不可裂解性，这种培养体系不提供细胞响应型的微环境。对于所嵌入细胞的生长而言必要的水凝胶重构只能通过肽的非特异性降解并由此通过整个水凝胶基质的分解来进行。据此对应地，在Zhang等人的研究中只能在非常短的时间段中(例如2-4天)进行细胞的3D培养。在Zhang的文献中明确指出“由于材料的较低刚度，长期培养在技术上是困难的”。此外，由于混入了从动物来源获得的层粘连蛋白，使得难以定义的、造成杂质或依赖于批次的产品质量波动的蛋白质变成了化验的组成部分，这招致对制备(方法)的可重现性的强烈怀疑。另外，由于该材料的较长的凝胶化时间(成凝胶时间)(20-30分钟)，可能出现局部去混合作用以及所嵌入的细胞中的不均匀性。从S.Koutsopoulos等人，Long-termthree-dimensionalneuraltissueculturesinfunctionalizedself-assemblingpeptidehydrogels，MatrigelandCollagenI，ActaBiomater.2013，Feb；9(2)；5162-5169已知-类似于的、非细胞响应型的自组织的肽的制造，其中培养了鼠的神经元细胞。J.Y.Sang，SimpleandNovelThreeDimensionalNeuronalCellCultureUsingaMicroMeshScaffold，ExpNeurobiol.2011Jun；20(2)；110-115的研究描述了在使用合成尼龙纤维作为骨架的情况下培养三维神经元。将神经元细胞与琼脂糖混合并且然后置于尼龙织物上。此类技术提供了人造的环境，在该环境中细胞被包封在细胞响应环境中，这不适合于模仿正在发育的脑部的活体环境。在US6306922A和US6602975A中描述了一种可生物分解的光聚合的水凝胶。然而在接近UV谱的波长下聚合可能由于形成自由基而造成在细胞培养体系中的细胞死亡和DNA突变。在本专利技术的体系中预期没有由于UV波引起的细胞损伤，因为在正常的实验室条件下且在没有UV光的情况下进行聚合。另外，取消UV诱发的光聚合物使得在此描述的水凝胶体系在高度专业化的实验室之外的应用变得明显更简单，因为不要求特殊的设备来进行聚合。
技术实现思路
本专利技术的目的在于，开发一种与上述先前公开物相比显著改进的与人类来源细胞相关的模块式体外体系或方法，该体系或方法在三维基质中形成功能性神经元网络。对于此类体系而言最重要的评价指标是神经元网络的质量，该神经元网络应尽可能模仿在中枢神经系统的神经元组织中的活体情形。另外该体系应容易操作并且为在没有高度专业化的实验室的情况下(例如还有在移植方法中)进行应用提供可靠的前景。这个目的以根据权利要求1所述的一种用于形成人类神经元细胞和神经胶质细胞的功能网络的方法来实现。改进方案在从属权利要求中给出。其他权利要求涉及该方法的用途。根据本专利技术，在用于形成人类神经元细胞和神经胶质细胞的功能网络的方法中，将这些细胞引入到具有成分聚乙二醇(PEG)和肝素的合成水凝胶体系并在其中培养。在此这些细胞预先已经与这些凝胶成分之一、即PEG或肝素混合并且与之一起引入到PEG-肝素水凝胶体系中，使得在该三维水凝胶聚合期间这些细胞已经处于该水凝胶体系中。有利地，在该方法中，将人类神经元细胞与神经胶质细胞共同培养，其中这些人类神经元细胞是人类神经元干细胞和前体细胞、或者源自无限增殖的人类神经元前体细胞系、或者是由中脑获得的原代人类神经元前体细胞。根据一个有利的实施方式，这些人类神经元细胞是来自诱导性多功能干细胞(iPSC)的人类神经干细胞和前体细胞或者衍生自原代人类皮层细胞。所形成的网络的功能尤其能够通过表达成熟的神经元皮层标记物、对神经递质的响应(例如以钙流入的形式)以及通过电生理学活性来描述。根据本专利技术的一个优选的实施变体，该PEG-肝素水凝胶体系是包含多臂聚乙二醇(星形PEG)的星形PEG-肝素水凝胶体系，该水凝胶体系优选通过可酶裂解的肽序列(MMP肽)来交联，由此该星形PEG-肝素水凝胶体系是可裂解的且可局部重构的。特别优选地，四臂聚乙二醇(四臂星形PEG)作为多臂聚乙二醇。在一个实施变体中，该水凝胶的水凝胶基质通过硫醇封端的星形PEG-肽共轭物和由马来酰亚胺(优选由4-6个马来酰亚胺基团)官能化的肝素的共价交联构成。在此该水凝胶基质的交联通过迈克尔加成来进行。替代地，该星形PEG-肝素水凝胶体系的水凝胶基质由肝素和共价的星形PEG-肽共轭物通过自组织来非共价地构成。在此，该星形PEG-肽共轭物包括两个或更多个肽的共轭物，这些共轭物耦合到聚合物链上。该肽序列包含重复的二肽模序(BA)n，其中B是具有带正电的侧链的氨基酸，A是丙氨酸，并且n是5至20、优选5或7的数。根据本专利技术的一个特别有利的实施方式，该水凝胶具有通过存储模量表征的可变的机械特性。该存储模量优选在300-600帕斯卡的范围内可变。存储模量的这个范围可以例如通过调节这两种材料成分的混合比(即通过改变交联度(与改变PEG对肝素的摩尔比同义))、或者通过改变材料成分的固体含量(即聚合原料的浓度)来改变并且优选借助于振荡式流变法来确定。在本专利技术的一个优选的实施方式中，用信号分子和/或用从细胞外基质(EZM)的蛋白质衍生的功能性肽单元(优选粘附肽)来改性该PEG-肝素水凝胶体系。根据本专利技术的另一种设计，与人类间充质干细胞和内皮细胞一起进行该人类神经元细胞和神经胶质细胞的共同培养，该人类间充质干细胞和本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于形成人类神经元细胞和神经胶质细胞的功能网络的方法，其中将这些细胞引入到具有成分聚乙二醇(PEG)和肝素的合成水凝胶体系中并在其中培养，其中这些细胞预先已经与这些凝胶成分之一、即PEG或肝素混合并且与之一起引入到PEG‑肝素水凝胶体系中，使得在形成该三维水凝胶期间这些细胞已经处于该水凝胶体系中。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.05.17 DE 102016109068.91.一种用于形成人类神经元细胞和神经胶质细胞的功能网络的方法，其中将这些细胞引入到具有成分聚乙二醇(PEG)和肝素的合成水凝胶体系中并在其中培养，其中这些细胞预先已经与这些凝胶成分之一、即PEG或肝素混合并且与之一起引入到PEG-肝素水凝胶体系中，使得在形成该三维水凝胶期间这些细胞已经处于该水凝胶体系中。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将这些人类神经元细胞与神经胶质细胞共同培养，并且这些人类神经元细胞是人类神经元干细胞和前体细胞、或者源自无限增殖的人类神经元前体细胞系、或者是由中脑获得的原代人类神经元前体细胞。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，这些人类神经元细胞是来自诱导性多功能干细胞(iPSC)的人类神经元干细胞和前体细胞或者衍生自原代人类皮层细胞。4.根据权利要求1-3之一所述的方法，其特征在于，该功能能够通过表达成熟的神经元皮层标记物、对神经递质的响应以及通过电生理学活性来描述。5.根据权利要求1至4之一所述的方法，其特征在于，该PEG-肝素水凝胶体系是包含多臂聚乙二醇(星形PEG)的星形PEG-肝素水凝胶体系，该水凝胶体系通过可酶裂解的肽序列来交联，由此该星形PEG-肝素水凝胶体系是可裂解的且可局部重构的。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，该水凝胶的水凝胶基质通过硫醇封端的星形PEG-肽共轭物和由马来酰亚胺官能化的肝素的共价交联构成，其中该水凝胶基质的交联通过迈克尔加成来进行。7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，该星形PEG-肝素水凝胶体系的水凝胶基质由肝素和共价的星形P...

【专利技术属性】
技术研发人员：克里斯托斯·帕帕季米特里乌，卡格汉·克孜尔，乌维·弗罗依登伯格，卡斯滕·韦纳尔，
申请(专利权)人：德累斯顿协会莱布尼茨聚合物研究所，德国神经疾病中心，
类型：发明
国别省市：德国,DE