本发明专利技术公开了一种检测丁香疫霉菌的LAMP引物对及其扩增方法与用途，属于植物病原真菌检测领域，自行设计合成了1套引物PS‑F3、PS‑B3、PS‑FIP和PS‑BIP，优化反应体系及扩增程序，建立了一种快速简便、特异性强、准确可靠的植物及植物产品中丁香疫霉菌分子检测方法，一个工作日内完成整个检测，用于对丁香疫霉基因组DNA的特异检测。
【技术实现步骤摘要】
检测丁香疫霉菌的LAMP引物对及其扩增方法和用途
本专利技术涉及使用LAMP技术检测植物及植物产品中丁香疫霉菌的方法，属于植物病原真菌检测领域。
技术介绍
丁香疫霉是疫霉属中重要的检疫性病原真菌，可引起寄主根、茎、叶、果实多种病害。如丁香的枝枯病（twigblight），苹果和梨的果腐病（fruitrot）和颈腐病（collarrot），板栗和山毛榉树的根腐病（rootrot），柑橘流胶病（gummosisofcitrus）。病菌可为害柑橘的所有生长阶段，导致果腐（brownrotoffruit）、根腐（rootrot），树干基部的脚腐（footrot），果实和枝干的流胶病（gummosisofCitrus）。受感染的植株长势衰弱，出现茎枯，叶片褪绿萎蔫，严重时整株死亡。丁香疫霉是典型的土壤习居菌，以带菌苗木火带菌土壤进行远距离传播，通常分布在果园的土壤中并且能够存活15年，在沼泽的土壤中分离生存2年的病原菌对丁香的致病性仍未减弱。在田间条件下，该病原菌通过雨水和灌溉传播。丁香疫霉引起的疫病已成为多个国家水果产业面对的难题，丁香疫霉已经成为国内各水果进境口岸重点关注的疫情之一，其传播途径多、为害严重、根除困难、病菌随果实传入我国的风险极高。目前疫霉菌常规生物学检测方法是植物带菌检测，经过分离培养可通过肉眼直接观察菌落、孢子囊、卵孢子等形态特征来进行鉴定。病原菌菌株培养时间需达20天左右才能诱激产生孢子囊，此种情况不仅耗时费力，疫霉病原菌的形态特征、培养性状及生理特性等极为相似，很难根据菌落形态、孢子囊的形态和脱落性、有性器官的产生和形态、厚垣孢子的有无、菌丝的生长温度等特性来准确、快速有效地鉴定出丁香疫霉，分子生物学方法如ELISA（Mohan.EvaluationofantiseraraisedagainstPhytophthorafragariaefordetectingtheredcorediseaseofstrawberriesbyenzyme-linkedimmunosorbentassay(ELISA).PlantPathology1988,37:206-216)、单克隆抗体(Burnsetal.Theuseofmonoclonalantibodiesforthedetectionoffungi.BulletinOEPP/EPPOBulletin.1995,25:31-38)等已有应用，但是只能检测到疫霉属的水平。目前的检测方法不能满足口岸检测“快验快放”的要求，易导致病害在我国传播。因此，加强对口岸进境植物产品携带疫霉的快速、准确的检测鉴定显得极为重要。环介导等温扩增技术（loop-mediatedisothermalamplification，LAMP）是日本学者Notomi等于2000年开发的一种新型恒温核酸扩增方法。该技术有灵敏度高、特异性强、方便简捷、检测周期短、仪器设备要求低等优点，大大降低了投入成本，具有较高的应用价值，目前已广泛应用于临床、食品安全、农业等领域。在植物病毒、细菌方面的应用也已相当成熟，如Fukuta等应用LAMP先后检测番茄黄化曲叶病毒（TYLCV）和番茄斑萎病毒（TSWV），Okuda等建立了黄龙病的LAMP检测方法等。但还没有将LAMP技术应用于丁香疫霉检测的报道。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是：设计丁香疫霉的LAMP引物，建立丁香疫霉的LAMP检测方法。为了解决该问题，本专利技术的解决方案是，设计丁香疫霉的特异LAMP引物，并建立特异LAMP方法。丁香疫霉的LAMP特异引物，序列如下：PS-F3：GAGTACTTTTCCTGCTGTGGTGPS-B3：TCCAATTGAGATGCCCACPS-FIP：CCGGAACAACCGTCACTCTAC-GTGAACCGTAGCTGTGTTTGPS-BIP：GCTGGAGTGACTGTCGAGG-CCGAAGTCGCACAGACACAA反应结束后，可通过肉眼观察反应液是否为白色浑浊（白色浑浊为阳性，否则为阴性）来判断扩增结果；也可在扩增产物中加入SYBRGreenI荧光染料观察颜色变化，反应液颜色由橙色变成绿色为阳性，否则颜色保持不变，用于丁香疫霉基因组DNA特异性检测。一种检测丁香疫霉菌的LAMP引物对及其扩增方法和用途，包括下述的扩增体系和扩增程序：（1）扩增体系建立25μL的扩增体系为，包括10×ThermoPoLBuffer2.5μL（200mmol/LTris-HCl、100mmol/LKCl、20mmol/LMgSO4、100mmol/L(NH4)2SO4、1.0%Tritonx-100）、2.5mmol/LdNTPs2.5μL、100mmol/LMgSO41μL、10mmol/LPS-F30.2μL、10mmol/LPS-B30.2μL、10mmol/LPS-FIP1.6μL、10mmol/LPS-BIP1.6μL、8U/μLBstDNAPolymerase1μL、DNA模板1μL，余量为双蒸水；（2）反应程序63℃水浴锅中反应60min，之后在85℃下灭活5min结束反应。一种检测丁香疫霉菌的LAMP引物对及其扩增方法的用途。本专利技术的有益效果是：建立了方法简便的丁香疫霉的LAMP特异性引物，能将丁香疫霉与其它疫霉区别开来。简化和方便了对该疫霉的检测，节约了检测时间，该方法快速、可靠，可有效在口岸检测中推广应用。附图说明图一是丁香疫霉菌的LAMP特异引物的扩增。A：琼脂糖凝胶电泳检测；B：副产物焦磷酸镁沉淀观察；C：SYBRGreenI荧光染料显色M：标准分子量；1：阳性样品1；2：阳性样品2；3：阴性对照；4：空白对照具体实施方式本专利技术的丁香疫霉菌LAMP特异性引物对，实现了丁香疫霉的快速检测。设计丁香疫霉菌的特异LAMP引物，序列如下：PS-F3：GAGTACTTTTCCTGCTGTGGTGPS-B3：TCCAATTGAGATGCCCACPS-FIP：CCGGAACAACCGTCACTCTAC-GTGAACCGTAGCTGTGTTTGPS-BIP：GCTGGAGTGACTGTCGAGG-CCGAAGTCGCACAGACACAA反应结束后，可通过肉眼观察反应液是否为白色浑浊（白色浑浊为阳性，否则为阴性）来判断扩增结果；也可在扩增产物中加入SYBRGreenI荧光染料观察颜色变化，反应液颜色由橙色变成绿色为阳性，否则颜色保持不变，或者采用琼脂糖凝胶电泳观察梯状条带的有无来判断。本专利技术建立一种检测丁香疫霉菌的LAMP引物对及其扩增方法，包括扩增体系的建立和扩增程序设立。（1）扩增体系建立25μL的扩增体系为，总体积为25μL，包括10×ThermoPoLBuffer2.5μL（200mmol/LTris-HCl、100mmol/LKCl、20mmol/LMgSO4、100mmol/L(NH4)2SO4、1.0%Tritonx-100）、2.5mmol/LdNTPs2.5μL、100mmol/LMgSO41μL、10mmol/LPS-F30.2μL、10mmol/LPS-B30.2μL、10mmol/LPS-FIP1.6μL、10mmol/LPS-BIP1.6μL、8U/μLBstDNAP本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种检测丁香疫霉菌的LAMP引物对及其扩增方法和用途，其特征在于，自行设计的冬生疫霉菌的LAMP特异引物对，实现了对冬生疫霉菌的特异检测。序列如下：PS‑F3：GAG TAC TTT TCC TGC TGT GGT GPS‑B3：TCCAATTGA GAT GCC CACPS‑FIP：CCG GAA CAACCG TCA CTC TAC‑GTGAAC CGTAGC TGT GTT TGPS‑BIP：GCT GGA GTGACT GTC GAG G‑CC GAA GTC GCA CAGACA CAA所述引物对用于植物及植物产品中丁香疫霉菌基因组DNA特异性检测。
【技术特征摘要】
1.一种检测丁香疫霉菌的LAMP引物对及其扩增方法和用途，其特征在于，自行设计的冬生疫霉菌的LAMP特异引物对，实现了对冬生疫霉菌的特异检测。序列如下：PS-F3：GAGTACTTTTCCTGCTGTGGTGPS-B3：TCCAATTGAGATGCCCACPS-FIP：CCGGAACAACCGTCACTCTAC-GTGAACCGTAGCTGTGTTTGPS-BIP：GCTGGAGTGACTGTCGAGG-CCGAAGTCGCACAGACACAA所述引物对用于植物及植物产品中丁香疫霉菌基因组DNA特异性检测。2.一种检测丁香疫霉菌的LAMP扩增体系：总体积为25μL，包括10×ThermoPoLBuffer2.5μL(200mmol/LTris-HCl、100mmol/LKCl、20mmol/...
【专利技术属性】
技术研发人员：姜一，牛春敬，张莹，
申请(专利权)人：天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心，
类型：发明
国别省市：天津,12
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