一种用于鉴别籼粳的SSR标记、筛选方法及应用技术

本发明专利技术属于分子生物学技术领域，尤其是涉及一种用于鉴别籼粳的SSR标记、筛选方法及应用。本发明专利技术所提供的筛选方法所筛选出来的SSR标记在1869份水稻品种DNA中进行扩增，扩增产物经毛细管电泳后结果显示：产物大小在籼稻和粳稻之间存在差异，产物大小为133 bp的水稻品种全部为粳稻，产物大小为136 bp的水稻品种，94%以上都为籼稻。

【技术实现步骤摘要】
一种用于鉴别籼粳的SSR标记、筛选方法及应用
本专利技术属于分子生物学
，尤其是涉及一种用于鉴别籼粳的SSR标记、筛选方法及应用。
技术介绍
栽培稻在植物分类学上属禾本科、竹亚科、稻族、稻属植物，可分为籼、粳两个亚种。在漫长的历史过程中形成了南籼北粳的布局。对它们的栽培、利用也有了较深的了解，一般来说，粳稻比较耐寒、耐肥、要求密植，而籼稻抗寒性弱，比较适应粗放的栽培。在中国，水稻育种是籼粳并重，在全球大体是纬度偏高的以粳稻为主，纬度低的以籼稻为主。籼稻和粳稻各有优点，杂交稻的推广以及广亲和稻种的发现使人们向往籼粳杂种优势的直接利用，但其先决条件都是正确鉴别籼粳。籼粳分类及其分化是稻作研究的重点之一。加藤等是最早应用现代科学进行稻种分类的，他以形态特征、杂交亲和性与血清反应为依据，将亚洲栽培稻分为籼稻、粳稻两个亚种，奠定了稻种分类的基础。过去区分籼粳常根据粒形、稃毛、叶毛有无，以及对苯酚的反应来划分。通常籼稻粒形长而细，而粳稻为短圆型；籼稻稃毛及叶毛较密而长，而粳稻较短，甚至没有稃毛及叶毛。粳稻对苯酚反应不敏感，而籼稻易在苯酚处理下呈现褐色表型。程侃声等人提出了以一系列形态指数(程式指数)，作为主要的籼粳分类指标，已被普遍应用于籼粳分类及亚种间杂交稻选育上。程式指数法是一种简便并可靠的多性状鉴定方法，但其需要大田种植才能完成所有性状调查，耗时长，不利于快速鉴定。随着功能基因组学和分子生物学的快速发展，利用分子标记来鉴定籼粳已成为一种快速而有效的方法。SSR标记亦称为微卫星标记或简单序列长度多态性标记，一般是由2-4对核苷酸组成重复单位(核心序列)重复几次至十几次所形成的长度为几十个核苷酸的串联重复序列在染色体上呈随机分布，由于重复程度的不完全及重复次数的变化而造成每个座位丰富的多态性，SSR标记是一种十分有价值的分子标记，目前已被广泛应用于水稻DNA指纹图谱的构建、群体和进化遗传研究、遗传多样性分析、种质资源保护与利用等研究领域。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的在于，针对现有技术中存在的不足，提供一种用于鉴别籼粳的SSR标记的筛选方法。为此，本专利技术的上述目的通过以下技术方案来实现：一种用于鉴别籼粳的SSR标记的筛选方法，所述用于鉴别籼粳的SSR标记的筛选方法包括如下步骤：(1)利用MISA工具对水稻整个基因组进行SSR位点查找；(2)根据查找到的SSR位点，依照其重复单元数目、在染色体所在的位置等信息在整个基因组上筛选出300多个SSR位点，并对其进行引物设计，最终得到368个SSR标记；(3)使用该368个SSR标记对少量水稻测试样品进行鉴定，针对其产物多态性及引物特异性进行筛选，最终筛选出均匀分布在12条染色体上的50对SSR引物；(4)利用最终筛选出来的50对引物对大量水稻品种进行扩增，利用毛细管电泳技术读取产物大小，从中筛选出可用于鉴别籼粳的SSR标记。若筛选出的SSR标记对籼粳扩增后的产物大小不一样，则可以说明该引物(SSR标记)可以初步区分籼粳。在采用上述技术方案的同时，本专利技术还可以采用或者组合采用以下进一步的技术方案：优选地，步骤(1)中的程序MISA(http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/misa.html)是利用perl语言开发的一种脚本程序。优选地，步骤(1)中水稻整个基因组为参照基因组日本晴的序列。优选地，步骤(2)中对SSR位点进行引物设计，是利用生物信息学软件primer3.0进行引物设计，然后经过PCR检测，最后得到的SSR引物即为SSR标记。优选地，步骤(3)中毛细管电泳是利用测序仪(ABI3730XL，USA)进行实验并分析产物大小。本专利技术的第二个目的在于，针对现有技术中存在的不足，提供一种用于鉴别籼粳的SSR标记。为此，本专利技术的上述目的通过以下技术方案来实现：一种用于鉴别籼粳的SSR标记，所述用于鉴别籼粳的SSR标记包括SEQIDNO.1的上游核苷酸序列和SEQIDNO.2的下游核苷酸序列，SEQIDNO.1和SEQIDNO.2的核苷酸序列分别如下：SEQIDNO.1：CTCCCGCTACGACGTCTCCSEQIDNO.2：CGATGCGCTGGAAGAGGTG。本专利技术还有一个目的在于，针对现有技术中存在的不足，提供一种用于鉴别籼粳的SSR标记在籼粳鉴别方面的应用。为此，本专利技术的上述目的通过以下技术方案来实现：一种根据前面所述的用于鉴别籼粳的SSR标记在籼粳鉴别方面的应用，其特征在于，利用前面所述的用于鉴别籼粳的SSR标记扩增不同的水稻品种，且扩增后的PCR产物大小在籼稻和粳稻之间存在差异：产物大小为133bp的水稻品种全部为粳稻，产物大小为136bp的水稻品种，94％以上都为籼稻。本专利技术提供一种用于鉴别籼粳的SSR标记、筛选方法及应用，筛选出来的SSR标记在1869份水稻品种DNA中进行扩增，扩增产物经毛细管电泳后结果显示：产物大小在籼稻和粳稻之间存在差异，产物大小为133bp的水稻品种全部为粳稻，产物大小为136bp的水稻品种，94％以上都为籼稻。附图说明图1为SSR标记在1869个水稻品种扩增产物中条带大小分布情况。图2为SSR标记扩增水稻品种的扩增产物的毛细管电泳结果。具体实施方式以下结合实施例来进一步解释本专利技术，但实施例并不对本专利技术做任何形式的限定。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。1.SSR的搜索与引物的设计MISA和primer3是基于perl语言开发的脚本工具，因此需要在电脑上安装perl，perl下载与安装：http://www.activestate.com/activeperl/下载所需版本；利用MISA工具(http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/misa.html)对水稻全基因组序列(http://rice.plantbiology.msu.edu/)进行SSR位点查找；根据搜索到的引物，利用生物信息学工具primer3.0进行批量设计引物，适用于perl的primer3的下载地址http://sourceforge.net/projects/primer3/files/primer3/1.1.4；在设计好的引物中，结合产物大小，SSR的位点的重复基元、重复数目以及在染色体上分布的位置等信息挑选出了368个SSR标记；这些标记的SSR重复基元及重复数目较多，产物大小80-200bp左右；用这368个SSR标记对100份水稻测试样品进行鉴定，针对其产物多态性及引物特异性进行筛选，综合工作量等因素，最终筛选出均匀分布在12条染色体上的50对SSR引物；利用最终筛选出来的50对引物对近2000份的水稻品种进行扩增，具体参照表1所示，利用毛细管电泳技术读取产物大小，从中筛选出可用于鉴别籼粳的SSR标记，表1为所用水稻品种基本信息和扩产产物大小结果；2.水稻基因组DNA的提取1)取约0.1g的水稻叶片用液氮研磨成粉状，然后加入700μl的DNA提取缓冲液，65℃水浴45～60min。或用剪刀剪取适量的组织样品于2ml离心管中，在离心管中加入一颗钢珠，然后再加入预热好的700μl的DNA本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于鉴别籼粳的SSR标记的筛选方法，其特征在于，所述用于鉴别籼粳的SSR标记的筛选方法包括如下步骤：（1）利用MISA工具对水稻整个基因组进行SSR位点查找；（2）根据查找到的SSR位点，依照其重复单元数目、在染色体所在的位置信息在整个基因组上筛选出300多个SSR位点，并对其进行引物设计，最终得到368个SSR标记；（3）使用该368个SSR标记对少量水稻测试样品进行鉴定，针对其产物多态性及引物特异性进行筛选，最终筛选出均匀分布在12条染色体上的50对SSR引物；（4）利用最终筛选出来的50对引物对大量水稻品种进行扩增，利用毛细管电泳技术读取产物大小，从中筛选出可用于鉴别籼粳的SSR标记。

【技术特征摘要】
1.一种用于鉴别籼粳的SSR标记的筛选方法，其特征在于，所述用于鉴别籼粳的SSR标记的筛选方法包括如下步骤：（1）利用MISA工具对水稻整个基因组进行SSR位点查找；（2）根据查找到的SSR位点，依照其重复单元数目、在染色体所在的位置信息在整个基因组上筛选出300多个SSR位点，并对其进行引物设计，最终得到368个SSR标记；（3）使用该368个SSR标记对少量水稻测试样品进行鉴定，针对其产物多态性及引物特异性进行筛选，最终筛选出均匀分布在12条染色体上的50对SSR引物；（4）利用最终筛选出来的50对引物对大量水稻品种进行扩增，利用毛细管电泳技术读取产物大小，从中筛选出可用于鉴别籼粳的SSR标记。2.根据权利要求1所述的用于鉴别籼粳的SSR标记的筛选方法，其特征在于，步骤（1）中水稻整个基因组为参照基因组日本晴的序列。3.根据权利要求1所述的用于鉴别籼粳的SSR标记的筛选...

【专利技术属性】
技术研发人员：魏兴华，杨窑龙，徐群，王珊，冯跃，袁筱萍，余汉勇，王一平，
申请(专利权)人：中国水稻研究所，
类型：发明
国别省市：浙江,33