本发明专利技术属于微生物动物病毒领域，具体涉及一种番鸭C亚型禽偏肺病毒弱毒株及其制备和应用。本发明专利技术的番鸭C亚型禽偏肺病毒弱毒株，保藏号为：CCTCC NO:V201823，核苷酸序列为SEQ ID NO：1，氨基酸序列为SEQ ID NO：2至SEQ ID NO：9。本发明专利技术的番鸭C亚型禽偏肺病毒弱毒株，通过将C亚型禽偏肺病毒S‑01株进行传代培养至50代制得。本发明专利技术首次获得番鸭C亚型禽偏肺病毒S‑01株致弱培养株，为弱毒苗的研制打下基础。
【技术实现步骤摘要】
一种番鸭C亚型禽偏肺病毒弱毒株及其制备和应用
本专利技术属于微生物动物病毒领域，具体涉及一种番鸭C亚型禽偏肺病毒弱毒株及其制备和应用。
技术介绍
禽偏肺病是由禽偏肺病毒(avianmetapneumovirus，aMPV)引起的上呼吸道感染的急性高度传染性疾病之一。禽肺病最开始在幼龄的火鸡中分离到，伴随着打喷嚏，气管啰音，鼻和眼中有黏着的分泌物，结膜炎等临床症状。因此称之为火鸡鼻气管炎。在1978年的南非，首次分离到aMPV，随后在欧洲，亚洲和南美也有报道。我国于1998年在有肿头综合征的鸡群中首次报道分离到禽肺病毒A亚型，2012年又陆续的在鸡群中分离到B、C亚型。2010年7月份在广东省某鸭场发生的以雏鸭、产蛋种鸭咳嗽，产蛋种鸭产蛋率异常下降为特征的鸭群中，分离到一株C亚型偏肺病毒，命名为S-01株，鸭源C亚型禽偏肺病毒仅仅在法国、加拿大有报道。目前用于aMPV的预防最有效的方法就是疫苗的使用，对于已经感染了的家禽，除了应用不同的抗生素降低发病程度和继发感染外，没有更有效的治疗方法。提高生物安全性及加强饲养环境的管理对该病的发生很重要，接种疫苗可以大大的降低发病率，可以减少经济损失。禽偏肺病毒以细胞免疫为主，目前，已经研发了很多针对aMPV的疫苗(弱毒疫苗和灭活苗)，但仅是针对于aMPV-A和aMPV-B亚型的细胞弱毒活疫苗得到全世界范围内广泛应用。aMPV不同亚型之间存在着交叉保护，尤其是aMPV-A和aMPV-B之间的交叉保护。但是不同aMPV-C株之间，aMPV-A、aMPV-B株与aMPV-C株之间交叉保护效果不是很理想。因此需要针对aMPV-C亚型毒株研制出弱毒苗。鸭源C亚型禽偏肺病毒仅仅在法国、加拿大有报道，针对于番鸭源的aMPV-C亚型的弱毒苗目前还未有报道。
技术实现思路
鉴于此，有必要针对上述问题提供一种鸭C亚型禽偏肺病毒弱毒株及其制备和应用，本专利技术首次得到鸭源C亚型禽偏肺病毒弱毒苗，致弱后毒株效价较致弱之前细胞毒价升高明显。本专利技术是通过以下技术方案实现的：一种番鸭C亚型禽偏肺病毒弱毒株，保藏号为：CCTCCNO:V201823；保藏单位：中国典型培养物保藏中心；保藏日期：2018年08月02日；保藏地址：中国.武汉.武汉大学；核苷酸序列为SEQIDNO：1所示。一种番鸭C亚型禽偏肺病毒弱毒株，保藏号为：CCTCCNO:V201823；保藏单位：中国典型培养物保藏中心；保藏日期：2018年08月02日；保藏地址：中国.武汉.武汉大学；所述弱毒株阅读框包括N基因、P基因、M基因、M2基因、SH基因、F基因、G基因、L基因，所述阅读框的氨基酸序列分别对应SEQIDNO：2至SEQIDNO：9。一种番鸭C亚型禽偏肺病毒弱毒株的制备方法，包括，将C亚型禽偏肺病毒S-01株进行传代培养代数为40-62代。进一步的，所述番鸭C亚型禽偏肺病毒弱毒株的制备方法，包括，将C亚型禽偏肺病毒S-01株进行传代培养至50代。进一步的，所述番鸭C亚型禽偏肺病毒弱毒株的制备方法，具体包括：用番鸭C亚型禽偏肺病毒S-01株，接种长满单层的非洲绿猴肾细胞(Vero)T25细胞瓶，每瓶接种100倍稀释的病毒液500ul；吸附2小时后，弃去病毒液，加入5ml含2％胎牛血清的DMEM培养液，培养24～96小时，至出现细胞病变；反复冻融3次，吸取病毒液接种下一代；如此操作，连续传代培养至40代，再用有限稀释法连续纯化5次后，继续传代培养。一种包含上述弱毒株或上述方法所制备的弱毒株的鸭免疫用制品，其中每份免疫制品中弱毒株的含量(即每只每次免疫用量)为≧102.5TCID50；优选≧104.5TCID50。本专利技术有益效果：目前暂无鸭源C亚型禽偏肺病毒弱毒苗的报导，本专利技术属于首次分离传代致弱培养。本专利技术致弱后毒株较稳定，S-01-42P、S-01-52P、S-01-62P都完全致弱，未出现不稳定现象。为了研制出能有效的防控鸭C亚型禽偏肺病毒的疫苗，本研究将番鸭C亚型禽偏肺病毒S-01株连续的在Vero细胞上传代培养，达到致弱的目的，为弱毒苗的研制打下基础。C亚型禽偏肺病毒S-01株经过在Vero细胞上的连续的传代，通过不同代次致病性试验，40代后毒株已经致弱。致弱后毒株效价较致弱之前细胞毒价升高明显，由原先的103.0TCID50/0.1ml变为105TCID50/0.1ml以上。本专利技术致弱后代次(S-01-50P)免疫原性最好，102.5TCID50/0.1ml临床保护可以达到100％，不能完全阻止排毒，104.5TCID50/0.1ml临床保护达到100％，而且完全可以阻止排毒。因此通过本研究结果选取S-01-50P作为弱毒疫苗候选株(致弱稳定，前10代，后10代均已经致弱)，104.5TCID50/0.1ml既可以达到100％的临床保护率及0％的排毒率。致弱株S-01-50P全基因序列的测序分析表明其与初始分离株S-01-5P相比，存在16个氨基酸的变异，这些氨基酸的变异与毒株毒力的变化有很大的关系。附图说明图1为发病鸭只鼻腔。图2为未发病鸭只鼻腔。具体实施方式为了更好地说明本专利技术所解决的问题、所采用的技术方案和所达到的效果，现结合具体实施例和相关资料进一步阐述。需要说明的是，本
技术实现思路
包含但不限于以下实施例及其组合实施方式。本专利技术实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购等途径获得的常规产品。实施例1鸭C亚型偏肺病毒的传代培养用实验室分离到的在自然界中引起番鸭发病的鸭C亚型禽偏肺病毒S-01株，接种长满单层的非洲绿猴肾细胞(Vero)T25细胞瓶，每瓶接种100倍稀释500ul病毒液，吸附2小时后，弃去病毒液，加入5ml含2％胎牛血清的DMEM培养液，24～96小时不等，培养至出现细胞病变，反复冻融3次，吸取病毒液接种下一代。连续传代培养至40代，后再连续用有限稀释法纯化5次后，传至62代。传代培养结果F3代鸭胚卵黄液接种Vero细胞，F1～F3代无明显病变，F4代在第4天出现细胞病变，悬浮细胞增多，合胞体出现等。F4代效价较低为103TCID50/0.1ml。随着传代次数的增加，病毒滴度变大，到F60达到105.5TCID50/0.1mL。传代过程中发现随着传代次数的增加细胞出现细胞病变的时间缩短，细胞病变也由原来的悬浮死细胞较少，合胞体形成较多，变为悬浮死细胞变多，合胞体变少。各传代代次效价见表1。表1S-01株不同传代代次效价的测定结果实施例2C亚型禽偏肺病毒S-01株传代代次致病性试验挑选将上述S-01株传代代次S-01-5P、S-01-17P、S-01-28P、S-01-32P、S-01-40P、S-01-50P、S-01-60P、Vero细胞液对照组共9组，点眼滴鼻感染两周龄雏鸭，感染剂量为104TCID50/ml，免疫后每天观察临床症状并记录每组发病鸭只的数目及严重程度，在免疫后第5天采集每组的泄殖腔拭子及喉拭子，每5个鸭只的拭子放在一个15ml的EP管里，进行RT-PCR检测，每组共6个待检测样品。通过观察统临床症状、剖检后病变，分析不同代次对鸭的致病力。(RT-PCR检测方法参考AliA,Reyn本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种鸭C亚型禽偏肺病毒弱毒株，保藏号为：CCTCC NO:V201823；核苷酸序列为SEQ ID NO：1。
【技术特征摘要】
1.一种鸭C亚型禽偏肺病毒弱毒株，保藏号为：CCTCCNO:V201823；核苷酸序列为SEQIDNO：1。2.根据权利要求1所述的番鸭C亚型禽偏肺病毒弱毒株，其特征在于，所述番鸭C亚型禽偏肺病毒弱毒株的阅读框氨基酸序列为SEQIDNO：2至SEQIDNO：9。3.一种番鸭C亚型禽偏肺病毒弱毒株的制备方法，其特征在于，包括：将番鸭C亚型禽偏肺病毒S-01株进行传代培养至40-62代。4.根据权利要求3所述的番鸭C亚型禽偏肺病毒弱毒株得制备方法，其特征在于，所述番鸭C亚型禽偏肺病毒弱毒株的制备方法，包括，将C亚型禽偏肺病毒S-01株进行传代培养至50代。5.根据权利要求3所述的番鸭C亚型禽偏肺病毒弱毒株得制备方法，其特征在于，所述番鸭C亚型禽偏肺病毒弱毒株的制备方法，具体包括：用番鸭C亚型禽偏肺病毒S-01株，接种长满单层的非洲...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘佳佳，陈峰，王占新，鲁俊鹏，覃健萍，操胜，
申请(专利权)人：温氏食品集团股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44
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