利用生物反应器生产轮状病毒的方法技术

本发明专利技术申请涉及轮状病毒的生产方法，尤其是利用潮汐式生物反应器生产轮状病毒的方法，包括Vero细胞的培养和病毒接种和培养，为适应潮汐式生物器的需要，生长液和维持液的配方添加了葡萄糖，潮汐式生物反应器系统原则上与转瓶系统非常的相似，它也是交替的将细胞暴露于空气与营养物质中，然而潮汐式的运动克服了转瓶系统的很多缺点，如劳动力和空间需求以及污染风险。

Production of rotavirus by Bioreactor

The application of the invention relates to the production method of rotavirus, in particular the method of producing rotavirus by using tidal bioreactor, including the culture of Vero cells and virus inoculation and culture. In order to meet the needs of tidal bioreactor, the formulation of growth liquid and maintenance liquid is added with glucose. The tidal bioreactor system is in principle very similar to the rotating bottle system, and it is also alternating. Tidal movements, however, overcome many drawbacks of the bottle-turning system, such as labor and space needs and pollution risks.

【技术实现步骤摘要】
利用生物反应器生产轮状病毒的方法
本专利技术申请涉及轮状病毒的生产方法，尤其是利用潮汐式生物反应器生产轮状病毒的方法。
技术介绍
目前，轮状病毒疫苗生产主要采用的是传统的转瓶培养、细胞工厂培养和发酵罐微载体培养。转瓶工艺细胞生长密度低，细胞贴壁不均一，病毒收率低且难以规模化生产。细胞工厂生产工艺由于是静态培养，细胞连续浸没在没有通气的浅培养基中，病毒增殖较慢，病毒收获率低。发酵罐微载体工艺虽然能够通过培养基的连续搅拌以实现营养和氧气的交换，但是这种搅拌会对微载体表面生长的细胞产生剪切应力，引起细胞的死亡，导致产物产量降低并增加了下游工艺生物难度和成本。因此开发新型的生产培养方式已成为一种趋势。
技术实现思路
本专利技术公开了一种利用生物反应器生产轮状病毒的方法，包括Vero细胞的培养和病毒接种和培养，其特征在于步骤如下：步骤1、Vero细胞的培养，将潮汐培养反应器置于二氧化碳培养箱中并将参数调整细胞的接种参数为Up:2mm/secT_H:20secDown:2mm/secB_H:0sec，将回温到37℃±0.5℃的450ml细胞生长液倒入体积为500ml的潮汐培养瓶中，然后将细胞分洒在CelCradle-500的载体上，培养5小时，然后进行截留率计算，并调整细胞培养参数；Vero细胞培养后的72小时进行一次换液，第72小时起，每24小时测量培养液的葡萄糖浓度一次，接近或低于1g/L则更换培养液；在整个Vero细胞培养阶段，每2-3天进行载体片取样计数细胞，待细胞数目到达3x109个，停止Vero细胞培养；步骤2、病毒接种和培养，（在步骤1培养Vero细胞的潮汐培养瓶中）加入20ug/ml胰酶和600ug/mlCaCl2，37℃孵育45min；然后用500ml维持液将潮汐培养瓶中的细胞洗1次，；将病毒以MOI0.05接种于潮汐培养瓶，拧紧瓶盖，将瓶子于37℃倒置培养2h；补加维持液至潮汐培养瓶内总的溶液的量为500ml，于37℃培养96小时收液，-20℃冻融一次，8000prm离心20min，去上清，-80℃保存，蚀斑检测病毒滴度。所述的生长液的配方，其特征在于添加了葡萄糖，具体如下：FBS100ml；谷氨酰胺4mM；葡萄糖3g/L；双抗10ml；NaHCO325ml；MEM补加至总体积1L。所述的维持液的配方，其特征在于添加了葡萄糖，具体如下：谷氨酰胺4mM；葡萄糖3g/L；双抗10ml；NaHCO328ml；MEM补加至总体积1L。与转瓶培养相比较，在潮汐式培养的生长液和维持液中我们添加了葡萄糖。葡萄糖作为糖类物质，能够为细胞的生长提供能量；另一方面由于潮汐式培养的载体较难在显微镜下直接观察细胞的形态，因此我们可以通过直接测定培养液中葡萄糖的浓度来判断细胞的生长状态。当葡萄糖浓度降低至1g/L时，提示我们培养液中营养消耗大，需要添加新的培养液。病毒的接种量MOI大大降低，转瓶培养时MOI为0.5，而潮汐培养时MOI为0.05；也就是接种时病毒的用量大大降低。规模化培养病毒是制备疫苗最基本的条件。目前，我们主要采用转瓶来生产轮状病毒。潮汐式生物反应器系统原则上与转瓶系统非常的相似，它也是交替的将细胞暴露于空气与营养物质中。然而潮汐式的运动克服了转瓶系统的很多缺点，如劳动力和空间需求以及污染风险。随着生产成本便的越来越昂贵，使用潮汐式生物反应器代替转瓶系统具有以下的优点：（1）一个潮汐式细胞培养瓶可以替代20个850cm2转瓶，在生产率相同的情况下，大大减少了空间的占用；（2）潮汐式生物反应器降低了污染，增强了对生产的控制；（3）生物反应器采用潮汐式原理允许简单的培养基更换和良好的培养及消耗效率，从而降低了培养基的消耗，大大降低了生产成本；（4）使用潮汐式生物反应器生产轮状病毒其滴度能够达到7.7LogPFU/ml，与转瓶培养相比，病毒滴度提高了50倍，这样高滴度的病毒有利于简化轮状病毒疫苗生产工艺。附图说明图1.VERO细胞在CelCradle-500瓶中的增殖曲线。图2.病毒不同增殖时间点的免疫荧光分析。图3.轮状病毒ZTR-68经潮汐培养基因组核酸带型。图4.轮状病毒电镜观察图。图5.病毒的增殖曲线。具体实施方式实施例1、材料选择Vero细胞由中国医学科学院医学生物学研究所分子生物室保存，代次为142代；毒株ZTR-68是G[1]P[8]型野生型毒株，它由中国医学科学院医学生物学研究所分子生物室从云南省昭通市一名婴幼儿的粪便中分离培养而来。生长液与维持液配方与转瓶培养相比较，在潮汐式培养的生长液和维持液中我们添加了葡萄糖。葡萄糖作为糖类物质，能够为细胞的生长提供能量；另一方面由于潮汐式培养的载体较难在显微镜下直接观察细胞的形态，因此我们可以通过直接测定培养液中葡萄糖的浓度来判断细胞的生长状态。当葡萄糖浓度降低至1g/L时，提示我们培养液中营养消耗大，需要添加新的培养液。1）生长液FBS100ml；谷氨酰胺4mM；葡萄糖3g/L；双抗10ml；NaHCO325ml；MEM补加至总体积1L。2）维持液谷氨酰胺4mM；葡萄糖3g/L；双抗10ml；NaHCO328ml；MEM补加至总体积1L。实施例2、Vero细胞的培养1）瓶子选用：CelCradle-500；2）准备50mL细胞培养液，内含有3x108Vero细胞；3）先将CelCradleStage-3000置于二氧化碳培养箱(37℃，5%CO2)，参数调整为接种细胞的参数；（Up:2mm/secT_H:10sec；Down:2mm/secB_H:0sec）4）先将回温到37℃的450ml细胞培养液倒入CelCradle-500瓶中；5）将准备好的50mL细胞分洒在CelCradle-500的载体上，锁上瓶盖，放置到CelCradleStage-300上，按下启动键，培养5小时；6）接种5小时后，进行截留率计算。吸取CelCradle-500内的培养基1mL，进行细胞计数，计算截留率，并更改细胞培养参数为（Up:1mm/secTopHold:20sec；Down:1mm/secBottomTime:30sec）；7）细胞培养阶段，第三天(72小时)起每天测量培养液的葡萄糖浓度一次，接近或低于1g/L则更换培养液(若72小时内，Glucose未低于1g/L，也需在72小时进行全换液)；8）细胞培养阶段，每隔2到3天进行载体片取样计数细胞；9）持续进行细胞培养，待细胞数目到达3x109个，即可停止。实施例3、病毒接种及培养1）病毒激活：加入20ug/ml胰酶和600ug/mlCaCl2，37℃孵育45min；2）用维持液将CelCradle-500瓶中的细胞洗1次3）将病毒以MOI0.05接种于CelCradle-500瓶，拧紧瓶盖，将瓶子于37℃倒置培养2h；4）补加维持液至500ml，于37℃培养，培养参数为：Up:1mm/secTopHold:20sec；Down:1mm/secBottomTime:30sec5）96小时收液，-20℃冻融一次，8000prm离心20min，去上清，-80℃保存。蚀斑检测病毒滴度。细胞增殖曲线，如图1所示，细胞接种后，每隔24h取样，进行活细胞的计数。从图中可以看出，细胞接种7天后，细胞的增殖到达平台期，一个C本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用生物反应器生产轮状病毒的方法，包括Vero细胞的培养以及病毒接种和培养，其特征在于步骤如下：步骤1、Vero细胞的培养，将潮汐培养反应器置于二氧化碳培养箱中并将参数调整细胞的接种参数为Up: 2 mm/sec T_H: 20 sec Down: 2 mm/sec B_H: 0 sec ，将回温到37 ℃±0.5℃的 450 ml 细胞生长液倒入体积为500ml的潮汐培养瓶中，然后将细胞分洒在潮汐培养瓶的载体上，培养5小时，然后进行截留率计算，并调整细胞培养参数；Vero细胞培养后的72小时进行一次换液，第72小时起，每24小时测量培养液的葡萄糖浓度一次，接近或低于 1 g/L则更换培养液；在整个Vero细胞培养阶段，每2‑3天进行载体片取样计数细胞，待细胞数目到达3 x 109个，停止Vero细胞培养；步骤2、病毒接种和培养，在步骤1培养Vero细胞的潮汐培养瓶中加入20ug/ml胰酶和600ug/mlCaCl2 ，37℃孵育45min；然后用500ml维持液将潮汐培养瓶中的细胞洗1次，；将病毒以MOI0.05接种于潮汐培养瓶，拧紧瓶盖，将瓶子于37℃倒置培养2h；补加维持液至潮汐培养瓶内总的溶液的量为500ml，于37℃培养96小时收液，‑20℃冻融一次，8000prm离心20min，去上清，‑80℃保存，蚀斑检测病毒滴度。...

【技术特征摘要】
1.一种利用生物反应器生产轮状病毒的方法，包括Vero细胞的培养以及病毒接种和培养，其特征在于步骤如下：步骤1、Vero细胞的培养，将潮汐培养反应器置于二氧化碳培养箱中并将参数调整细胞的接种参数为Up:2mm/secT_H:20secDown:2mm/secB_H:0sec，将回温到37℃±0.5℃的450ml细胞生长液倒入体积为500ml的潮汐培养瓶中，然后将细胞分洒在潮汐培养瓶的载体上，培养5小时，然后进行截留率计算，并调整细胞培养参数；Vero细胞培养后的72小时进行一次换液，第72小时起，每24小时测量培养液的葡萄糖浓度一次，接近或低于1g/L则更换培养液；在整个Vero细胞培养阶段，每2-3天进行载体片取样计数细胞，待细胞数目到达3x109个，停止Vero细胞培养；步骤2、病毒接种和培养，在步骤1培养Vero细胞的潮汐培养瓶中加入20ug/ml胰酶和6...

【专利技术属性】
技术研发人员：李鸿钧，尹娜，周艳，张光明，吴晋元，
申请(专利权)人：中国医学科学院医学生物学研究所，
类型：发明
国别省市：云南,53