水稻转录因子OsHRS1突变体构建方法及其在水稻干旱胁迫中的应用技术

本发明专利技术属于作物遗传育种领域，具体涉及一种水稻转录因子OsHRS1突变体构建方法及其在水稻干旱胁迫中的应用。该基因为水稻MYB家族转录因子基因OsHRS1,其序列如图1所示。水稻转化的功能分析表明OsHRS1在水稻干旱胁迫中具有重要作用，还可用于其它作物的抗逆转基因应用。该抗逆基因来自植物本身，对环境影响小。

Construction of Rice Transcription Factor OsHRS1 Mutant and Its Application in Rice Drought Stress

The invention belongs to the field of Crop Genetics and breeding, in particular to a construction method of rice transcription factor OsHRS1 mutant and its application in rice drought stress. The gene is OsHRS1, a transcription factor gene of rice MYB family, whose sequence is shown in Figure 1. Functional analysis of rice transformation indicated that OsHRS1 played an important role in rice drought stress, and could be used in other crops for anti-reversal gene application. The stress resistance gene comes from the plant itself and has little impact on the environment.

【技术实现步骤摘要】
水稻转录因子OsHRS1突变体构建方法及其在水稻干旱胁迫中的应用
本专利技术属于作物遗传育种领域，具体涉及水稻转录因子OsHRS1突变体构建方法及其在水稻干旱胁迫中的应用。
技术介绍
水资源短缺是一个主要的农业问题，缺极大地影响了植物的生长和发育，降低了作物产量。在人类总用水量中，70％是农业用水。因此对于研究作物节水抗旱机制，减少当前和未来的干旱风险具有重要意义。水稻是中国最主要的粮食作物之一，也是农业用水第一大户，如何提高水稻水分利用效率，开展水稻节水抗旱研究，发展节水型水稻，缓解水资源的供需矛盾，在农业节水抗旱中具有突出意义。因此对水稻进行抗旱性研究，减少农业生产用水显得尤为重要。在干旱条件下，植物激活各种代谢防御系统维持生长，例如通过降低蒸腾速率提高水稻的节水耐旱性。植物主要是通过蒸腾消耗大量水分，而蒸腾主要是通过调节气孔运动(张开和关闭)来减少水分流失(Sirichandraetal.2009)。气孔位于植物叶片表皮，位于植物叶子表皮中的气孔控制CO2在蒸腾过程中对光合作用和水分流失的吸收，因此在节水耐旱中具有重要作用。OsHRS1是MYB家族转录因子，大部分MYB蛋白具有转录激活作用，但有的MYB蛋白也可以降低目的基因表达。有研究表明，在拟南芥中AtMYB2蛋白在对脱水、盐胁迫和ABA的应答过程中起到转录调控作用。到目前为止，有关MYB家族转录因子的研究大部分来自拟南芥，而在水稻中的研究报道并不多。本专利技术以水稻为研究材料，有关OsHRS1的研究主要是与花发育相关而在非生物胁迫中没有报道。
技术实现思路
为了克服上述缺陷，本专利技术的目的是利用水稻转录因子OsHRS1基因的敲除材料，并进一步公开了水稻转录因子OsHRS1基因在水稻节水耐旱中的应用。本专利技术提供水稻转录因子OsHRS1基因的敲除引物，所述的敲除引物序列如SEQIDNo.1-2所示。本专利技术还提供水稻转录因子OsHRS1基因的敲除靶位点，所述的靶位点如SEQIDNo.3所示。通过CRISPR-Cas9技术，获得水稻转录因子OsHRS1基因敲除材料。具体包括以下步骤：(1)克隆水稻转录因子OsHRS1基因；(2)RT-PCR方法获得水稻转录因子OsHRS1基因片段，依据CRISPR-Cas9技术原理，设计OsHRS1的突变靶位点，将带有靶位点的核苷酸序列与BGK03载体相连得到转化质粒，转化农杆菌；(3)将带有转化质粒的农杆菌采用转基因方法转化日本晴水稻，得到OsHRS1敲除材料；(4)OsHRS1敲除材料蒸腾表型分析；(5)OsHRS1敲除材料蒸腾速率气孔导度的测定；(6)OsHRS1敲除材料气孔观察。本专利技术公开水稻转录因子OsHRS1突变体构建方法，通过CRISPR-Cas9技术，获得水稻转录因子OsHRS1基因敲除材料，敲除材料即水稻转录因子OsHRS1突变体。本专利技术通过对OsHRS1基因在水稻受干旱胁迫时的表达模式判断，推断该基因参与植物抗逆途径。根据该基因的序列设计敲除靶位点引物(SEQIDNo.3)，利用RT-PCR技术从水稻品种日本晴总cDNA中扩增得到OsHRS1基因。通过CRISPR-Cas9技术获得OsHRS1敲除材料，研究其敲除后水稻中的抗逆功能，为OsHRS1基因在其它植物上的应用提供了很好的基础。本专利技术所述的水稻OsHRS1基因可用于水稻转化，将其敲除后降低水稻的节水耐旱能力。本专利技术还公开了一种提高水稻节水耐旱能力的方法，即利用水稻OsHRS1基因敲除载体(即水稻OsHRS1基因敲除质粒)转化目标水稻，从而获得OsHRS1敲除材料。所述的提高植物耐旱能力的方法，包括下述步骤：(1)获得水稻转录因子基因OsHRS1核酸序列及氨基酸序列；(2)用RT-PCR方法获得水稻转录因子OsHRS1基因片段(利用SEQIDNo.1-2)；根据CRISPR/Cas9技术原理，在OsHRS1外显子区域靠近起始密码ATG区域选择一段19bp的序列(5’-CTGGACCTGAAGATGTTCG-3’)(SEQIDNO.3)作为靶位点；即RT-PCR合成的水稻转录因子OsHRS1基因片段，在基因片段5'端加上靶位点序列SEQIDNo.3以形成水稻转录因子OsHRS1基因敲除片段(即带有靶位点的核苷酸序列)，然后将水稻转录因子OsHRS1基因敲除片段连接到百格公司的BGK03载体得到水稻OsHRS1基因敲除质粒，再转化农杆菌感受态细胞；(3)用带有水稻OsHRS1基因敲除质粒(即前述的转化质粒)的农杆菌转化目标植物，之后进行转基因阳性苗的鉴定；(4)目标植物转基因T2代阳性纯合植株的筛选；(5)转基因纯合植株的节水耐旱分析。本专利技术根据OsHRS1基因的序列设计如下引物：上游引物F：5’-ACCCTTCCTCCAGTTCTTG-3’(SEQIDNO.1)，下游引物R:5’-TCCACGAGCACGATCTTTC-3’(SEQIDNO.2)。利用RT-PCR技术从水稻日本晴总cDNA中扩增得到OsHRS1基因全长cDNA(开放阅读框部分)。按Roche公司的RevertAidTMFirstStrandcDNASynthesisKit说明书操作进行第一链合成。根据OsHRS1基因的序列设计如下引物，F：5’-ACCCTTCCTCCAGTTCTTG-3’(SEQIDNO.1)和R：5’-TCCACGAGCACGATCTTTC-3’(SEQIDNO.2)为RT-PCR引物，利用RT-PCR进行cDNA扩增，扩增条件为：95℃预热3min；95℃,10s，60℃,30s，72℃,2min，共35个循环；72℃,10min。PCR结束后进行电泳分析，采用康为世纪公司的胶回收试剂盒回收约1700bp的扩增片段。将胶回收片段连接T载体转化感受态细胞，挑取白色菌落进行菌落PCR以鉴定阳性克隆，将阳性克隆送到南京金斯瑞公司测序经测序表明为MYB家族转录因子，OsHRS1的全长cDNA为1227bp，编码一个由409个氨基酸组成的蛋白。根据CRISPR/Cas9技术原理，在OsHRS1外显子区域靠近起始密码ATG区域选择一段19bp的序列(5’-CTGGACCTGAAGATGTTCG-3’)(SEQIDNO.3)作为靶位点，该序列3’端PAM序列为CGG。CRISPR/Cas9表达载体BGK03的靶序列由水稻U6启动子驱动，编码Cas9蛋白基因由加强型玉米(UBI)启动子驱动。将合成靶位点的核苷酸序列与百格公司的BGK03载体相连命名为BGK03-OsHRS1。本专利技术根据OsHRS1基因的敲除靶位点序列设计如下检测引物，扩增大小为419bp：F:5’-GTTGTGATTGGAGGCTGGCA-3’(SEQIDNO.4)，R:5’-TTTTGTGTGTGCAGGTCCGA-3’(SEQIDNO.5)。本专利技术的OsHRS1基因是能够针对性调控植物节水能力提高的转录因子基因；且该抗逆基因来自水稻本身，对环境影响较小。本专利技术通过对OsHRS1基因转化水稻进行该基因的功能研究，获得了对水稻节水耐旱具有重要研究价值的转基因水稻；OsHRS1基因在水稻节水耐旱过程中具有重要作用，为利用该基因在其他植物上的应用而提高植物抗逆性提供了理论依据及利用价值。附图说明图1OsHR本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.水稻转录因子OsHRS1基因的敲除引物，其特征在于，所述的敲除引物序列如SEQ ID No.1‑2所示。

【技术特征摘要】
1.水稻转录因子OsHRS1基因的敲除引物，其特征在于，所述的敲除引物序列如SEQIDNo.1-2所示。2.水稻转录因子OsHRS1基因的敲除靶位点，其特征在于，所述的靶位点如SEQIDNo.3所示。3.水稻转录因子OsHRS1基因在水稻节水耐旱中的应用。4.根据权利要求3所述的水稻转录因子OsHRS1基因在水稻节水耐旱中的应用，其特征在于，通过CRISPR-Cas9技术，获得水稻转录因子OsHRS1基因敲除材料。5.根据权利要求3所述的水稻转录因子OsHRS1基因在水稻节水耐旱中的应用，其特征在于，包括以下步骤：1）克隆水稻转录因子OsHRS1基因；2）用RT-PCR方法获得水稻转录因子OsHRS1基因片段，依据CRISPR-Cas9技术原理，设计OsHRS1的突变靶位点，将带有靶位点的核苷酸序列与BGK03载体相连得到转化质粒，转化农杆菌；3）将带有转化质粒的农杆菌采用转基因方法转化日本晴水稻，得到OsHRS1敲除材料；4）OsHRS1敲除材料蒸腾表型分析；...

【专利技术属性】
技术研发人员：高勇，陈建民，张梦娇，朱光，陶海霞，李婷婷，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32