3，8’’-联芹菜甙元在制备蛋白质N-乙酰葡萄糖胺修饰抑制剂中的应用制造技术

本发明专利技术公开了3，8”‑联芹菜甙元在制备蛋白质N‑乙酰葡萄糖胺修饰抑制剂中的应用，3，8”‑联芹菜甙元作用受体为N‑乙酰葡萄糖胺转移酶；3，8”‑联芹菜甙元通过与UDP结合口袋内His920，Thr922、Gln839、Phf837和Ala896形成氢键，进而占据N‑乙酰葡萄糖胺转移酶的UDP结合口袋，抑制N‑乙酰葡萄糖胺转移酶活性。通过体外及细胞内的OGT抑制活性分析发现，3，8”‑联芹菜甙元具有较好的OGT抑制活性，能够有效抑制蛋白质的O‑GlcNAc修饰。同时3，8”‑联芹菜甙元不会影响细胞内蛋白质的其他糖基化修饰，说明3，8”‑联芹菜甙元是特异性OGT抑制剂。

Application of 3,8'-biapigenin in the preparation of protein N-acetylglucosamine modified inhibitors

The invention discloses the application of 3,8\biapigenin in the preparation of protein N_acetylglucosamine modified inhibitors, 3,8\biapigenin action receptor is N_acetylglucosamine transferase; 3,8\biapigenin forms hydrogen bonds with His920, Thr922, Gln839, Phf837 and Ala896 in UDP binding pockets, thus occupying UDP of N_acetylglucosamine transferase. Combining with pockets, the activity of N acetylglucosaminotransferase was inhibited. In vitro and intracellular analysis of OGT inhibitory activity showed that 3,8\ Meanwhile, 3,8\

【技术实现步骤摘要】
3，8’’-联芹菜甙元在制备蛋白质N-乙酰葡萄糖胺修饰抑制剂中的应用
本专利技术涉及3，8”-联芹菜甙元的新应用，具体涉及3，8”-联芹菜甙元在制备蛋白质N-乙酰葡萄糖胺修饰抑制剂中的应用，其对N-乙酰葡萄糖胺转移酶(OGT)的抑制作用。
技术介绍
N-乙酰葡萄糖胺修饰(O-GlcNAc修饰)是一种普遍存在于胞内的蛋白质翻译后修饰，这种单糖修饰能够调节细胞质，线粒体和细胞核内多种蛋白质的功能。研究表明，O-GlcNAc糖基化修饰与几乎所有重大疾病和重要的生理病理过程相关。目前，细胞内已发现超过3000种蛋白能够发生O-GlcNAc修饰。N-乙酰葡萄糖胺转移酶(OGT)通过将底物糖供体尿嘧啶二磷酸-N-乙酰葡糖胺(UDP-GlcNAc)上的N-乙酰葡萄糖胺部分，转移到底物蛋白的丝氨酸或苏氨酸残基上，调控蛋白质的O-GlcNAc修饰。OGT存在于几乎所有的哺乳动物细胞内。OGT基因在生物体内组成型表达，敲除OGT基因都会导致生物体正常生理功能的变化，引起死亡。目前OGT与底物糖功能的共结晶已经得到解析，对其活性口袋与底物作用的氨基酸残基也得到了确认。既然OGT的活性与包括神经退行性疾病、糖尿病、癌症等一系列疾病的发生发展密切相关，那么通过化学手段抑制OGT活性，将有望调节这些生理过程。3，8”-联芹菜甙元是一种天然产物，是双黄酮的衍生物，化学名为：5,5',7,7'-四羟基-2,2'-2-(4-羟基苯基)-[3,8'-2-(苯并吡喃)]-4,4'-二酮，结构式如下：3，8”-联芹菜甙元属于黄酮类化合物，已报道的生物活性包括调节血糖、血脂，抗氧化等，但其分子机制不明。
技术实现思路
本专利技术旨在提供3，8”-联芹菜甙元在制备OGT抑制剂，抑制蛋白质O-GlcNAc修饰中的应用。3，8”-联芹菜甙元在制备蛋白质N-乙酰葡萄糖胺修饰抑制剂中的应用，3，8”-联芹菜甙元作用受体为N-乙酰葡萄糖胺转移酶；3，8”-联芹菜甙元通过占据N-乙酰葡萄糖胺转移酶的UDP结合口袋抑制其活性。进一步地，3，8”-联芹菜甙元通过与UDP结合口袋内His920、Thr922、Gln839、Phf837和Ala896形成氢键，进而以竞争性抑制方式占据N-乙酰葡萄糖胺转移酶的UDP结合口袋，抑制N-乙酰葡萄糖胺转移酶活性。本专利技术的有益效果为：通过体外及细胞内的OGT抑制活性分析发现，3，8”-联芹菜甙元具有较好的OGT抑制活性，能够有效抑制蛋白质的O-GlcNAc修饰。同时3，8”-联芹菜甙元不会影响细胞内蛋白质的其他糖基化修饰，说明3，8”-联芹菜甙元是特异性OGT抑制剂。附图说明图1是UDP荧光法检测不同浓度的3，8”-联芹菜甙元在体外对OGT活性的抑制效果，进一步计算获得IC50值。图2是3，8”-联芹菜甙元与OGT蛋白结合的Autodock结果示意图图3是UDP-OGT的结合模式图。图4是不同浓度3，8”-联芹菜甙元处理COS7细胞，利用Westernblot检测细胞内蛋白质的O-GlcNAc糖基化改变。图5是浓度固定，作用时间不同的3，8”-联芹菜甙元处理COS7细胞，利用Westernblot检测细胞内蛋白质的O-GlcNAc糖基化改变。具体实施方式下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本专利技术，但不以任何方式限制本专利技术。下述实施例中，如无特殊说明，所使用的实验方法均为常规方法，所用材料、试剂等均可从化学试剂公司购买。实施例1：通过UDP发光法检测3，8”-联芹菜甙元在体外对OGT的抑制活性。合成一个带有17个氨基酸的CKII3K肽段(氨基酸：KKKYPGGSTPVSSANMM)，采用UDP发光法在无细胞体系中检测OGT抑制剂活性。UDP发光法实验：用于该实验的UDP-Glo糖基转移酶活性检测试剂盒从Promega(目录号V6961)购买，实验步骤主要按照UDP-Glo实验产品说明书要求进行。1.UDP发光法检测不同浓度的3，8”-联芹菜甙元在体外对OGT活性的抑制效果：测定IC50值的3，8”-联芹菜甙元作用浓度分别为0.025、0.076、0.23、0.69、2.1、6.2、18.5、56、167、500μM。实验中使用白色384孔板，利用荧光酶标仪检测。该实验以125μMCKII3K肽段为OGT受体，细胞外实验体系包含以下组分：pH7.4条件下，300nM大肠杆菌表达的His标签的OGT蛋白，125μM的CKII3K肽段，对应浓度的3，8”-联芹菜甙元和100μM的UDP-GlcNAc溶解在1×OGT反应缓冲液中。按照UDP-Glo试剂盒说明书要求，该反应体系在常温下孵育1小时后，加入等体积的UDP-Glo核苷酸检测试剂，混匀后在室温下孵育1小时。利用荧光酶标仪读取荧光发光值，数据由MicrosoftExcel和Prism6(Graphpad)软件分析，用蛋白抑制率对化合物剂量对数作图求出IC50值。结果如附图1所示(数据表示为平均值±s.e.m.，n＝3)，随着3，8”-联芹菜甙元浓度的增加，OGT酶活性出现相应的降低，这说明3，8”-联芹菜甙元以浓度依赖方式在胞外抑制OGT的糖基转移酶活性，经计算其IC50值为12.88μM。实施例2：使用Autodock软件模拟计算3，8”-联芹菜甙元与OGT蛋白的结合模式。OGT(PDB:3PE3)蛋白结构由蛋白质数据库ProteinDataBank(PDB)中获得。化合物的三维结构利用Chembio3DUltra11.0进行能量优化获得最优构象。使用AutoDockTools软件对蛋白文件和小分子配体(3，8”-联芹菜甙元)进行预处理，并使用AutoDock4.0软件的LamarckianGeneticAlgorithm(GA)算法进行分子对接计算，对接结果用AutoDockTools软件显示。在分子对接过程中，收集100个构象，考虑溶剂化效应，介电常数取基于距离的模式，与网格计算有关的其它参数取为默认值。配体每次允许移动最大距离为0.1nm；最大角度为180.00度；对小分子中需要自由旋转的化学键均匀许自由旋转；优化时极小化1000步。在此基础上综合考虑复合物能量与结构因素确定3，8”-联芹菜甙元与OGT蛋白的结合模式。结果如附图3所示，3，8”-联芹菜甙元可以很好的模拟天然底物UDP与OGT蛋白形成相互作用，模拟UDP的磷酸基团的His920、Thr922、Gln839、Phf837和Ala896形成氢键。综上所述，3，8”-联芹菜甙元可以很好的占据OGT蛋白的UDP结合口袋，抑制OGT蛋白的糖基转移酶活性。实施例3：通过Westernblot法检测3，8”-联芹菜甙元在细胞内对OGT的抑制活性。1.利用不同浓度3，8”-联芹菜甙元处理COS7细胞，利用Westernblot检测细胞内蛋白质的O-GlcNAc糖基化改变：4小时葡萄糖饥饿后，将COS7细胞接种于6孔培养板培养(2×105个/孔)，分别加入溶于终浓度为0、20、50、100、150μM的3，8”-联芹菜甙元。药物作用24小时后收集细胞样品，以1×106/50μl细胞裂解液(6M尿素、2M硫脲、65mMDTT、4％CHAPS、40mMTrisbase)低温裂解，离心，取蛋白上清，按照1：1本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.3,8”‑联芹菜甙元在制备蛋白质N‑乙酰葡萄糖胺修饰抑制剂中的应用，其特征在于，3,8”‑联芹菜甙元作用受体为N‑乙酰葡萄糖胺转移酶；3,8”‑联芹菜甙元通过占据N‑乙酰葡萄糖胺转移酶的UDP结合口袋抑制其活性。

【技术特征摘要】
1.3,8”-联芹菜甙元在制备蛋白质N-乙酰葡萄糖胺修饰抑制剂中的应用，其特征在于，3,8”-联芹菜甙元作用受体为N-乙酰葡萄糖胺转移酶；3,8”-联芹菜甙元通过占据N-乙酰葡萄糖胺转移酶的UDP结合口袋抑制其活性。2.根据权利要求1所述的3,8”-联芹菜甙元在制备蛋...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘宇博，张娜娜，张嘉宁，
申请(专利权)人：大连理工大学，
类型：发明
国别省市：辽宁,21