一种口蹄疫抗原的定量方法技术

本发明专利技术提供了一种口蹄疫抗原的定量方法，所述方法包括以下步骤：A、配置不同浓度的口蹄疫抗原标准样品，采用HPLC对标准样品进行测定，获得标准抗原浓度和抗原吸收峰面积的关联公式；B、将待测样品进行预处理，然后采用HPLC测定其抗原吸收峰面积，根据步骤A的关联公式计算待测样品的抗原浓度。本发明专利技术解决了HPLC无法在口蹄疫病毒定量中的无法广泛使用的困境，使得HPLC使用范围更加广泛和准确。且本发明专利技术采用添加杂蛋白的预处理，可大大缩短样品的处理时间，提高检测的准确性。

A Quantitative Method for Foot and Mouth Disease Antigen

The invention provides a quantitative method for foot and mouth disease antigen. The method comprises the following steps: A. Configuring standard samples of foot and mouth disease antigen with different concentrations, using HPLC to determine the standard samples, obtaining the correlation formula of standard antigen concentration and antigen absorption peak area; B. Pretreating the samples to be tested, then using HPLC to determine the antigen absorption peak area, according to the steps. A correlation formula was used to calculate the antigen concentration of the tested samples. The invention solves the dilemma that the HPLC can not be widely used in the quantification of foot-and-mouth disease virus, and makes the use range of the HPLC wider and more accurate. The method adopts the pretreatment of adding impurity proteins, which can greatly shorten the processing time of samples and improve the accuracy of detection.

【技术实现步骤摘要】
一种口蹄疫抗原的定量方法
本专利技术涉及口蹄疫抗原的定量分析
，具体涉及一种口蹄疫抗原的定量方法。
技术介绍
口蹄疫(FMD)是由口蹄疫病毒(FMDV)引起的一种急性、热性、高度接触传染性和可快速远距离传播的动物疫病，侵染对象是猪、牛、羊等主要畜种及其它家养和野生偶蹄动物，易感动物多达70余种。目前，疫苗免疫是口蹄疫诸多防制措施中最重要也是最成功的措施之一，其中常规灭活疫苗是当前口蹄疫免疫防控的最主要疫苗。口蹄疫定量分析方法目前以蔗糖梯度密度为主，检测程序复杂，不适合快速检测。而开发利用高效液相层系统(HPLC)进行定量已成为口蹄疫抗原定量的趋势。专利CN104634891A中公开了一种快速、准确、重复性好的口蹄疫疫苗抗原146S测定方法，选取了分子量分离范围为2×104-1×107Da的色谱柱，在高效液相色谱仪上对被检测的样品进行色谱分离，用于口蹄疫抗原含量的鉴定。然而，该方法在实际操作时，和普遍的HPLC方法一样，当待测定样品的溶液体系(包括缓冲溶液组分、电导、pH范围)不同时，其测得的样品浓度出现明显浮动。即待测样品的溶液体系尤其是电导可明显影响HPLC的定量结果。专利技术人在前期进行了如下试验：分别采用浓度为5μg/mL的标准口蹄疫疫苗抗原146S样品制备成不同氯化钠浓度(电导分别为：54.6mS/cm和5mS/cm)的标准样品，采用专利CN104634891A中的方法进行定量分析，结果分别为7.9μg/ml和4.8μg/mL。其结果偏差可达33％,不能用于不同溶液条件下口蹄疫抗原含量的准确测定。在口蹄疫抗原的制备过程溶液电导会随加工流程发生变化，以及产品批次的电导也会发生偏差，由此导致在实际操作中，仍存在结果的准确性不高的问题。且专利技术人前期利用三根全新的TSK-G4000SWXL色谱柱对破乳疫苗进行反复检测中，其使用寿命分别为312次，241次，449次，色谱柱使用寿命短主要是葡聚糖凝胶的耐压性差，易被破乳样品中残留的佐剂污染，难以清洗造成。此外，在抗原样品的预处理过程中，通常采用常规的PEG沉淀法对病毒样品沉淀，但由于待测样品病毒浓度过低(通常不大于20μg/mL)，无法在较短时间内获得沉淀，通常需静置过夜才能进行后续的步骤，无法达到高效、快速、准确的要求，而常规的超滤浓缩后再PEG沉淀的方式又会造成病毒在膜上的吸附，形成的损失无法确定，影响测定结果的可靠性。
技术实现思路
针对现有技术中的缺陷，本专利技术提供了一种高效、快速的口蹄疫抗原的定量方法。本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的：本专利技术提供了一种口蹄疫抗原的定量方法，所述方法包括以下步骤：A、配置不同浓度的口蹄疫抗原标准样品，采用HPLC对标准样品进行测定，获得抗原浓度和抗原吸收峰面积的关联公式；B、将待测病毒溶液进行预处理，然后采用HPLC测定其抗原吸收峰面积，根据步骤A的关联公式计算待测样品的抗原浓度。优选地，步骤A中，所述关联公式为：C＝a×PA+b其中C为抗原浓度，单位为μg/ml；PA为吸收峰面积，单位为mAU×s；所述a和b为常数，分别为a＝0.0542，b＝0.494。优选地，所述各标准样品和经预处理后的待测病毒溶液体系相同，包括缓冲溶液组分、电导、pH范围相同。优选地，所述HPLC测定时，采用的色谱柱为AgilentBioSEC系色谱柱，更优选AgilentBioSEC-5色谱柱。优选地，所述AgilentBioSEC系色谱柱填充的硅胶填料的粒径为3～6μm，孔径优选地，所述采用AgilentBioSEC系色谱柱进行测定的条件为：流动相为含高盐或者低盐的磷酸缓冲溶液，pH7.0～8.5。更优选地，所述HPLC测定时，测定条件为：流动相为含0.1M硫酸钠的磷酸缓冲液，其pH值为7.2；流速为1ml/min；进样量为100μl，检测波长为259nm。优选地，步骤B中，所述预处理的步骤包括：在待测病毒溶液中加入杂蛋白，再添加PEG后，离心获得沉淀，再将沉淀进行复溶，即可。优选地，所述杂蛋白在待测病毒溶液中的终浓度为0.5～10mg/mL。优选地，所述杂蛋白的分子量为10～200kD。优选地，所述杂蛋白包括白蛋白、细胞因子、抗体分子，及重组表达的非酶类蛋白，例如牛血清白蛋白、干扰素、IgG。优选地，所述离心的条件为：2～10℃下，3000g～10000g离心15～60分钟。优选地，所述PEG的添加量为5％～20％；更优选PEG添加量为6％～15％。本专利技术在待测样品中故意添加杂蛋白，使总蛋白浓度达到2mg/mL以上，然后再添加PEG可快速获得沉淀，复溶后病毒没有损失，并且由于杂蛋白的分子量和病毒的差距太远，也不会干扰HPLC检测，同时实现样品的均一化处理的目的。本专利技术所述的定量方法不仅适用于口蹄疫抗原，还适用于其他病毒或类病毒颗粒抗原的定量，均可达到相同的效果。现有技术相比，本专利技术具有如下的有益效果：1)本专利技术解决了HPLC无法在口蹄疫病毒定量中的无法广泛使用的困境，使得HPLC使用范围更加广泛和准确。2)本专利技术采用AgilentBioSEC系列色谱柱，是硅胶系列属于硬胶，耐压性能远高于TSKG4000SWXL以及Superdex200。BioSEC-5比SW4000XL能承受的流速更高，测定时间更短，可将检测时间从30分钟缩短到20分钟，使用寿命更长，TSKG4000SWXL检测破乳样品的次数在500次以内，500次以后分辨能力易丧失，而BioSEC-5在1000次样品检测后依旧稳定，因此检测的综合成本更低。3)本专利技术通过提高病毒抗原样品中蛋白的总浓度，使得加入PEG后离心可快速获得病毒沉淀，获得的沉淀复溶后即可进行检测，大大缩短了样品的处理时间，提高了检测效率。且在蛋白沉淀过程中，由于病毒抗原会优先于杂蛋白先沉淀，因此，该快速方法处理不会造成病毒抗原沉淀不完全而导致结果不准确。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本专利技术，但不以任何形式限制本专利技术。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利技术构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本专利技术的保护范围。以下实施例提供了一种口蹄疫抗原的定量方法，所述方法包括以下步骤：A、配置不同浓度的口蹄疫抗原标准样品，采用HPLC对标准样品进行测定，获得抗原浓度和抗原吸收峰面积的关联公式；B、将待测病毒溶液进行预处理，然后采用HPLC测定其抗原吸收峰面积，根据步骤A的关联公式计算待测样品的抗原浓度。步骤A中，所述关联公式为：C＝a×PA+b其中C为抗原浓度，单位为μg/ml；PA为吸收峰面积，单位为mAU×s；所述a和b为常数，分别为a＝0.0542，b＝0.494。所述各标准样品和经预处理后的待测病毒溶液体系相同，包括缓冲溶液组分、电导、pH范围相同。所述HPLC测定时，采用的色谱柱为AgilentBioSEC系色谱柱，更优选AgilentBioSEC-5色谱柱。所述AgilentBioSEC系色谱柱填充的硅胶填料的粒径为3～6μm，孔径所述采用AgilentBioSEC系色谱柱进行测定的条件为：流动相为含高盐或者低盐的磷酸缓冲溶液，pH7.0～8.5。所述HPLC测定时，测定条件为：流动相为含0.1M硫酸钠本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种口蹄疫抗原的定量方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：A、配置不同浓度的口蹄疫抗原标准样品，采用HPLC对标准样品进行测定，获得抗原浓度和抗原吸收峰面积的关联公式；B、将待测病毒溶液进行预处理，然后采用HPLC测定其抗原吸收峰面积，根据步骤A的关联公式计算待测样品的抗原浓度。

【技术特征摘要】
1.一种口蹄疫抗原的定量方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：A、配置不同浓度的口蹄疫抗原标准样品，采用HPLC对标准样品进行测定，获得抗原浓度和抗原吸收峰面积的关联公式；B、将待测病毒溶液进行预处理，然后采用HPLC测定其抗原吸收峰面积，根据步骤A的关联公式计算待测样品的抗原浓度。2.根据权利要求1所述的口蹄疫抗原的定量方法，其特征在于，步骤A中，所述关联公式为：C＝a×PA+b其中C为抗原浓度，单位为μg/ml；PA为吸收峰面积，单位为mAU×s；所述a和b为常数，分别为a＝0.0542，b＝0.494。3.根据权利要求1所述的口蹄疫抗原的定量方法，其特征在于，所述各标准样品和经预处理后的待测病毒溶液的溶液体系相同。4.根据权利要求1所述的口蹄疫抗原的定量方法，其特征在于，所述HPLC测定时，采用的色谱柱为AgilentBioSEC系色谱柱。5.根据权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：张新廉，马贵军，张丽，俞爱敏，姬明放，石海芳，刘自立，郁莉，
申请(专利权)人：申联生物医药上海股份有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31