The invention discloses a fast and simple method for gene synthesis, which includes the following steps: dividing the gene sequence to be synthesized into several positive oligonucleotide chains and corresponding reverse complementary oligonucleotide chains, staggering 4_8 NT between two adjacent reverse complementary chains, and completely reverse complementation of the rest; synthesizing positive and negative oligonucleotide chains; amplifying linearity by restriction endonuclease digestion or PCR. Vectors; forward oligonucleotide chains and reverse complementary oligonucleotide chains were mixed and annealed to obtain double-stranded DNA fragments containing multiple notches; the double-stranded DNA fragments were mixed with linearized vectors and linked to target vectors by T4 ligase; the conjugates in step 5 were transferred to competent cells for bacterial detection and sequencing verification. The invention does not need to go through the process of PCR and gel recovery and purification, greatly reduces man-made errors and cross-contamination caused by various steps, and saves time and cost.
【技术实现步骤摘要】
一种快速简便的基因合成方法
本专利技术涉及基因工程领域,具体是一种快速简便的基因合成方法。
技术介绍
随着计算机、生物信息、基因测序等技术的不断发展,使全基因乃至基因组人工合成成为可能,基因合成是指运用生物学方法在体外合成所需DNA双链的技术,它不仅可以对已有基因进行改造,还能创造出自然界中不存在的基因,即“改造生命”和“人造生命”。目前基因的从头合成的主要方法是基于PCR技术的聚合酶循环组装PCA(Polymerasecyclingassembly)法,PCA法需将基因序列正向链与其反向互补链分别分割成多个寡核苷酸链(40-80nt),且相邻的正向与反向寡核苷酸链之间有15-25nt的重叠区,利用重叠延伸PCR技术原理将含有同源序列的DNA连接在一起,并在DNA聚合酶的作用下延伸,最终获得基因全序列。这种方法虽然成本较低,原理简单易用,但缺陷明显,如整个流程操作繁琐,需要经过PCR反应、产物回收、组装载体、转化等操作;对于复杂DNA序列(高GC、高AT、重复序列、Poly结构、回文结构),往往因PCR难以扩增而导致合成失败;由于PCR中酶的保真性、离子浓度、循环条件等因素的影响,及PCR本身会将引物中错误渗入的碱基放大而导致合成的错误率较高。本专利技术基于上述PCA法缺陷,提供了一种快速简便基因合成的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种快速简便的基因合成方法,以解决上述
技术介绍
中提出的问题。为实现上述目的,本专利技术提供如下技术方案:一种快速简便的基因合成方法,包括如下步骤:步骤一将待合成基因序列分成若干正向寡核苷酸链和相对应的反向互补寡核苷酸 ...
【技术保护点】
1.一种快速简便的基因合成方法,其特征在于,包括如下步骤:步骤一 将待合成基因序列分成若干正向寡核苷酸链和相对应的反向互补寡核苷酸链,相邻两条反向互补链之间相互错开4‑8nt,其余部分完全反向互补;步骤二 合成步骤一中正反寡核苷酸链;步骤三 使用限制性内切酶酶切或PCR扩增线性化载体;步骤四 将步骤三中正向寡核苷酸链和反向互补寡核苷酸链分别混合,退火,得到含有多个缺刻的双链DNA片段;步骤五 将步骤四得到的缺刻的双链DNA片段与步骤三得到的线性化载体混合,利用T4连接酶将多个双链DNA片段与目标载体连接成环;步骤六 将步骤五中连接产物转移至感受态细胞,菌检,测序验证。
【技术特征摘要】
1.一种快速简便的基因合成方法,其特征在于,包括如下步骤:步骤一将待合成基因序列分成若干正向寡核苷酸链和相对应的反向互补寡核苷酸链,相邻两条反向互补链之间相互错开4-8nt,其余部分完全反向互补;步骤二合成步骤一中正反寡核苷酸链;步骤三使用限制性内切酶酶切或PCR扩增线性化载体;步骤四将步骤三中正向寡核苷酸链和反向互补寡核苷酸链分别混合,退火,得到含有多个缺刻的双链DNA片段;步骤五将步骤四得到的缺刻的双链DNA片段与步骤三得到的线性化载体混合,利用T4连接酶将多个双链DNA片段与目标载体连接成环;步骤六将步骤五中连接产物转移至感受态细胞,菌检,测序验证。2.根据权利要求1所述的快速简便的基因合成方法,其特征在于,步骤四中,退火过程中加入的正向寡核苷酸链和反向互补寡核苷酸链的量相同。3.根据权利要求...
【专利技术属性】
技术研发人员:雍金贵,
申请(专利权)人:通用生物系统安徽有限公司,
类型:发明
国别省市:安徽,34
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