一种具有调控巨噬细胞免疫功能活性的蛋白质制造技术

本发明专利技术公开了一种具有调控巨噬细胞免疫功能活性的蛋白质，属于生物技术领域。本发明专利技术首次筛选并验证了PvTrag28蛋白在调节巨噬细胞免疫方面的应用，Western Blot结果显示PvTrag28蛋白可显著的促进未活化的RAW264.7巨噬细胞向M1型巨噬细胞方向极化。将PvTrag28蛋白作用于未活化的RAW264.7巨噬细胞，可显著增强RAW264.7巨噬细胞分泌NO、IL‑2、IL‑6、TNF‑α的能力，使IL‑6、TNFα、IL‑2和iNOS的mRNA水平分别上调约4.2倍、8.4倍、12.7倍和8.7倍。

A protein with immunoregulatory activity of macrophages

The present invention discloses a protein with immunoregulatory activity of macrophages, which belongs to the field of biotechnology. The present invention screens and validates the application of PvTrag28 protein in regulating macrophage immunity for the first time. Western Blot results show that PvTrag28 protein can significantly promote the polarization of inactivated RAW264.7 macrophages toward M1 macrophages. The effect of PvTrag28 protein on inactivated RAW264.7 macrophages significantly enhanced the ability of RAW264.7 macrophages to secrete NO, IL_2, IL_6 and TNF_a, and increased the levels of IL_6, TNF_a, IL_2 and iNOS by 4.2, 8.4, 12.7 and 8.7 times, respectively.

【技术实现步骤摘要】
一种具有调控巨噬细胞免疫功能活性的蛋白质
本专利技术涉及一种具有调控巨噬细胞免疫功能活性的蛋白质，属于生物

技术介绍
免疫是人体的一种生理功能，人体依靠这种功能识别“自己”和“非己”成分，从而破坏和排斥进入人体的抗原物质(如病菌等)，或人体本身所产生的损伤细胞和肿瘤细胞等，以维持人体的健康。抵抗或防止微生物或寄生物的感染或其它所不希望的生物侵入的状态。因此，免疫力被定义为人体识别和排除异己成分的生理反应，人体内执行这一功能是免疫系统。在当代社会，随着社会的进步发展，生活压力也进一步增加，很大一部分人群处于高幅度压力之下，长期会导致机体免疫功能下降，即免疫力降低。在此不健康状态下，机免疫系统不能正常发挥保护作用，极易招致细菌、病毒、真菌等感染，极易生病；机体的消耗加大，体质虚弱、营养不良、精神萎靡、疲乏无力、食欲降低、睡眠障碍等表现，长此以往会导致身体和智力发育不良，还易诱发重大疾病。因此增强机体免疫功能是当今社会必须重视的一个现状问题。巨噬细胞属免疫细胞，是一种极具异质性的细胞群体，广泛分布在机体组织器官中，在炎症反应、病原体防御和损伤修复中有均发挥重要作用，并能够作为抗原递呈细胞提呈抗原激活免疫应答。巨噬细胞存在一系列连续的功能状态，而M1和M2型巨噬细胞是这已连续状态的两个极端。其中M1型巨噬细胞通过分泌促炎症细胞因子，并专职提呈抗原，参与正向免疫应答，例如M1型巨噬细胞能够分泌NO、TNFα、IL-6、IL-12等促炎因子，参与病原微生物的清除；而M2型通过分泌抑制性细胞因子IL-10和/或TGF-B等下调免疫应答,在免疫调节中发挥重要作用，例如，则大量分泌IL-10和TGF-β等抗炎因子，参与炎症的消解、组织重塑、血管生成。因此探索调控巨噬细胞定向极化靶点在临床治疗中有非常重要的意义。疟疾是伴随人类出现最早的疾病，至今仍是全球范围内最重要的感染性疾病之一。目前关于疟疾的研究大多数集中在不同种属疟原虫入侵机制和疟疾疫苗的研发，而对疟原虫的药用价值或潜在的临床应用价值研究较少。疟原虫主要通过虫体表面或内部携带的蛋白与肝细胞或红细胞表面受体结合后侵入到机体内。本课题组在对间日疟原虫蛋白进行分析筛选发现PvTrag28是一个的输出蛋白，目前PvTrag28对巨噬细胞的作用尚未见相关研究。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供PvTrag28重组蛋白在制备调控巨噬细胞的产品方面的应用。在本专利技术的一种实施方式中，所述应用包括制备调控巨噬细胞的药物。在本专利技术的一种实施方式中，所述药物由SEQIDNO.1所示的蛋白和药学上可接受的载体组成。在本专利技术的一种实施方式中，所述应用包括促进未活化巨噬细胞向M1型方向极化。在本专利技术的一种实施方式中，所述药物包括但不限于免疫调节剂。在本专利技术的一种实施方式中，所述巨噬细胞为未活化的巨噬细胞，包括但不限于RAW264.7细胞。在本专利技术的一种实施方式中，所述药物是促进未活化巨噬细胞向M1型方向极化的药物。在本专利技术的一种实施方式中，所述药物是上调iNOs、IL-2、IL-6、TNF-α基因的表达的药物。本专利技术的第二个目的是提供制备PvTrag28重组蛋白的方法，所述方法是将来源于疟原虫的PvTrag28蛋白在体外表达。在本专利技术的一种实施方式中，所述方法包括如下步骤：(1)设计引物，扩增编码所述PvTrag28蛋白的基因，将该基因片段连接到载体上，获得重组质粒；(2)将重组质粒转化到相应的表达细胞中，诱导目的蛋白表达。在本专利技术的一种实施方式中，所述方法具体包括如下步骤：(1)设计引物，用如SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示引物扩增编码所述PvTrag28蛋白的基因片段，将扩增的基因片段连接到载体上，得到的重组质粒转化到克隆细胞中，提取重组质粒并测序；(2)将测序正确含有目的基因的重组质粒转化到相应的表达细胞中，用IPTG诱导目的蛋白表达。在本专利技术的一种实施方式中，所述表达载体可以为原核细胞表达载体、真核细胞表达载体或昆虫细胞表达载体。在本专利技术的一种实施方式中，所述的表达细胞可以为原核表达细胞、真核表达细胞或昆虫细胞。在本专利技术的一种实施方式中，所述表达载体为pET28a(+)，所述表达细胞为E.coliBL21(DE3)。本专利技术还要求保护所述PvTrag28蛋白在制备非医药用途的产品方面的应用。有益效果：本专利技术首次筛选并验证了PvTrag28蛋白在调节巨噬细胞免疫方面的应用，WesternBlot结果显示PvTrag28蛋白可显著的促进未活化的RAW264.7巨噬细胞向M1型巨噬细胞方向极化。将PvTrag28蛋白作用于未活化的RAW264.7巨噬细胞，可显著增强RAW264.7巨噬细胞分泌NO、IL-2、IL-6、TNF-α的能力，使IL-6、TNFα、IL-2和iNOS的mRNA水平分别上调约4.2倍、8.4倍、12.7倍和8.7倍。附图说明图1为PvTrag28蛋白考马斯亮蓝染色示意图(A)和Westernblotting检测图(B)；图2为Westernblotting法检测PvTrag28对RAW264.7细胞极化的影响；图3为Elisa法检测PvTrag28对RAW264.7细胞分泌IL-2、IL-6、TNF-α的影响；图4为Griess法检测PvTrag28对RAW264.7细胞分泌NO的影响；图5为RT-PCR验证PvTrag28对RAW264.7细胞iNOs、IL-2、IL-6、TNF-α基因表达量的影响。具体实施方式实施例1PvTrag28重组质粒的构建原核表达质粒pET28a(+)、宿主菌BL21(DE3)及诱导用的IPTG均购自北京全式金生物科技有限公司；限制性内切酶、T4DNA连接酶、pfuDNA聚合酶、dNTP均购自TakaRa公司。引物的合成和核苷酸序列测序均由苏州金唯智生物科技有限公司完成。琼脂糖亲和介质镍柱(Ni)购自QIAGEN公司。His-Taq标签抗体购自CellSignalingTechnology公司。设计引物通过PCR获取间日疟原虫PvTrag28蛋白的基因序列，引物如下：SEQIDNO.3：GGATCCATGAGATTGTTACTCGCCGTT；SEQIDNO.4：CTCGAGTTTTTCTAATTCTTTACACCATGA，其中GGATCC为SEQIDNO.3的酶切位点BamHⅠ；CTCGAG为SEQIDNO.4的酶切位点XhoⅠ。以卵形疟原虫基因组为模板，通过PCR扩增获得小鼠PvTrag28基因序列(如SEQIDNO.2所示)，扩增程序：94℃预变性3min，94℃变性10s、50℃退火30s、72℃延伸90s，循环35次，最后72℃延伸10min。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测目的基因扩增条带，然后经过胶回收后，用BamHⅠ及XhoⅠ限制性内切酶对PCR产物及pET28a(+)37℃酶切2h，通过T4连接酶将目的基因过夜连接到原核表达载体pET28a(+)。将连接的重组质粒转化E.coliDH5α感受态细胞：从-80℃取出E.coliDH5α细胞。立即放置于冰上,取连接的产物4μL加入到50μl感受态细胞中，混匀冰浴30min，42℃热激90后取出置于冰浴中2min。在管中加入无抗性的LB培养基1ml本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.PvTrag28重组蛋白在制备调控巨噬细胞的产品方面的应用，其特征在于，所述PvTrag28重组蛋白含有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

【技术特征摘要】
1.PvTrag28重组蛋白在制备调控巨噬细胞的产品方面的应用，其特征在于，所述PvTrag28重组蛋白含有SEQIDNO.1所示的氨基酸序列。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用包括制备调控巨噬细胞的药物。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述药物包括但不限于免疫调节剂。4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述药物由SEQIDNO.1所示的蛋白和药学上可接受的载体组成。5.根据权利要求2～4任一所述的应用，其特征在于，所述药物是促进未活化巨噬细胞向M1型方向极化的药物。6.根据权利要求2～4任一所述的应用，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：程洋，付海田，石晓丹，玄英花，雷瑶，沈飞虎，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32