一种伯氏疟原虫配子体重组蛋白（rPbG37）及其制备方法和在疟疾传播阻断中的应用技术

本发明专利技术属于免疫学领域，具体涉及一种伯氏疟原虫配子体重组蛋白(rPbG37)及其制备方法和在疟疾传播阻断中的应用。所述的伯氏疟原虫配子体重组蛋白(rPbG37)的氨基酸序列为SEQ ID NO：1；或与序列SEQ ID No.1限定的氨基酸序列同源性在95‑100％编码相同功能蛋白质的氨基酸序列；或SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经增加、缺失或替换一个或多个氨基酸且具有同等活性的衍生的蛋白。该重组蛋白是一种新型的具有传播阻断效应的重组蛋白，能够进一步提高疟疾传播阻断效果。

Plasmodium vivax gamete weight group protein (rPbG37), preparation method thereof and application in malaria transmission interruption

The invention belongs to the field of immunology, in particular to a Plasmodium gametophyte weight protein (rPbG37) of Plasmodium vivax and a preparation method thereof and an application thereof in malaria transmission interruption. Plasmodium berghei gamete weight group (rPbG37) protein and the amino acid sequence of SEQ ID NO:1 or; amino acid sequence limit and sequence of SEQ ID No.1 95 homology in 100% encoding amino acid sequence of the protein with the same functions; the amino acid sequence of ID No.1 or SEQ shown by adding, deletion or replace one or more amino acids and has the same activity derived protein. The recombinant protein is a novel recombinant protein with transmission blocking effect, which can further enhance the transmission blocking effect of malaria.

【技术实现步骤摘要】
一种伯氏疟原虫配子体重组蛋白(rPbG37)及其制备方法和在疟疾传播阻断中的应用
本专利技术属于免疫学领域，具体涉及一种伯氏疟原虫配子体重组蛋白(rPbG37)及其制备方法和在疟疾传播阻断过程中的应用。
技术介绍
疟疾是疟原虫经媒介按蚊传播的一种严重威胁人类健康的感染性寄生虫疾病，最新WHO全球疟疾报告指出，仅2015年全球仍有约429000人死于疟疾。在疟疾的高密度流行区，目前可用的抗疟疾方法已经不足以阻断疟疾传播，耐药蚊虫与疟原虫的增加与流行更加增大了控制疟疾的难度。因此，国际疟疾消除专家委员会(MalERA)认为控制疟疾传播的关键措施是研发新的控制方法，有效地阻断疟疾的传播，而疫苗无疑是完成这项工作的最佳武器。疟疾疫苗主要分三大类：红前期疫苗、红内期疫苗以及传播阻断疫苗(TBVs)；其中：红前期疫苗与红内期疫苗可降低疟疾的感染率与临床发病率，但两者的候选抗原均暴露于人体免疫系统，受到人体免疫压力等因素的影响，候选抗原存在广泛的基因多态性，传播阻断疫苗不仅可以阻断疟疾流行的传播，且其候选抗原主要表达于蚊虫阶段疟原虫表面，不受脊椎动物免疫系统选择压力的影响，显示出较低的多态水平，不会出现抗原变异，更有利于疫苗的免疫效果。因此,TBVs被认为是加速疟疾控制和最终根除疟疾的新策略。TBVs的效应机制是以蚊阶段疟原虫表达的特异性虫体表面蛋白作为抗原刺激机体产生抗蚊阶段疟原虫表面蛋白的特异性抗体。当蚊吸入被免疫的人血后，抗蚊阶段疟原虫表面蛋白的特异性抗体与蚊中肠内发育的疟原虫发生特异性结合，进而阻断蚊体内疟原虫的进一步发育。因此，TBVs可以阻断按蚊将疟原虫从一个宿主传播至另一个宿主。TBVs候选抗原主要表达于疟原虫的有性生殖阶段，即配子体至动合子发育阶段。目前，研究发现的TBVs候选抗原非常有限，如P230、P48/45、P25和P28。但这几种疟原虫有性阶段疫苗候选抗原诱导的特异性抗体尚不能达到令人满意的传播阻断效果。因此，疟疾防控的重点策略是迫切需要筛选并增加新型疟原虫有性阶段候选抗原，并制备重组蛋白，为后续开发高效、安全的TBV疫苗提供有效靶点。
技术实现思路
针对上述存在的问题，本专利技术目的在于提供一种伯氏疟原虫配子体重组蛋白(rPbG37)及其制备方法和在疟疾传播阻断中的应用。为了实现上述目的，本专利技术提供的具体方案如下。本专利技术提供的伯氏疟原虫配子体重组蛋白(rPbG37)的氨基酸序列为SEQIDNO：1；或与序列SEQIDNo.1限定的氨基酸序列同源性在95-100％编码相同功能蛋白质的氨基酸序列；或SEQIDNo.1所示的氨基酸序列经增加、缺失或替换一个或多个氨基酸且具有同等活性的衍生的蛋白。所述的合成用于编码伯氏疟原虫配子体重组蛋白具有63个氨基酸，其位于PbG37全长蛋白的第26-88位氨基酸残基位置，其氨基酸序列为SEQIDNo.1：Lys-Gln-Asp-Val-Tyr-Leu-Asp-Asp-Glu-Phe-Lys-Ser-Phe-Thr-Phe-Phe-Phe-Ala-Ser-Ser-Pro-Ser-Ala-Asn-Phe-Leu-Ser-Arg-Ile-Val-His-Ser-Asn-Glu-Ala-Lys-Phe-Thr-Gln-Ile-Lys-Asn-Lys-Thr-Asp-Ile-Trp-Asn-Lys-Thr-Ile-Asp-Lys-Ala-Tyr-Ser-Ile-Asn-Gln-Val-Ser-Asn-Asn。本专利技术还提供编码上述伯氏疟原虫配子体重组蛋白的基因，由含编码上述重组蛋白的基因对的重组表达载体也属于本专利技术的范围，所述的重组表达载体由含有疟疾传播阻断的重组蛋白的基因原核表达载体组成，所述的原核载体为pET-32a表达载体。所述的编码该重组蛋白的核苷酸为189bp，其核苷酸序列为SEQIDNO：2：AAACAGGATGTTTATTTGGATGATGAATTCAAAAGTTTCACGTTTTTTTTTGCTTCTTCCCCATCGGCTAATTTTTTGTCCCGGATTGTCCATAGCAATGAAGCGAAATTTACCCAAATAAAAAACAAAACAGATATATGGAACAAAACAATAGACAAAGCATACTCAATTAATCAGGTTTCAAATAAT。优选的，所述的重组表达载体为大肠杆菌DH-5α表达菌株。为了实现上述目的，本专利技术还提供了上述重组蛋白的制备方法，所述方法包括引物的设计、目的基因的扩增、重组表达载体的构建、重组蛋白的表达和纯化。所述的伯氏疟原虫配子体重组蛋白PbG37在制备疟疾传播阻断疫苗中的应用。本专利技术的显著效果。本专利技术旨在通过生物信息学的分析和分子生物学的实验验证，提供一种新型的具有传播阻断效应的重组蛋白，以进一步提高疟疾传播阻断效果。本专利技术所述的重组蛋白是通过对伯氏疟原虫进行生物信息学分析，预测出配子体表达的一种表面蛋白，设计截短片段，在大肠杆菌中诱导表达、纯化，并进行动物免疫，获得免疫血清，验证其传播阻断效应。为进一步确定其功能,我们还制备了相应的抗体和基因敲除虫株,通过功能实验,明确其传播阻断效果。应该明确的是，本领域技术人员可根据本专利技术公开的SEQIDNo.1氨基酸序列，在不影响其蛋白生物活性的前提下，对于其实施取代、缺少和/或增加一个或多个氨基酸，蛋白质序列比对同源性在95％以上，所得到所述蛋白的突变体序列。因此，本专利技术还包括对SEQIDNo.1所示的氨基酸序列经取代、缺少和/或增加一个或多个氨基酸得到高同源性且具有生物活性和相同功能的衍生蛋白。本专利技术还提供了一种基因打靶技术敲除伯氏疟原虫配子体蛋白(PbG37)后获得虫株Δpbg37。由含上述重组蛋白目的基因两侧同源臂的重组打靶载体也属于本专利技术的范围，该重组打靶载体分别插入目的基因两侧同源臂，含有hDHFR耐药基因用来筛选阳性克隆虫株。该打靶载体为PL0034表达载体。本专利技术还提供了一种含有上述重组打靶载体的大肠杆菌TG1菌株。本专利技术首次用分子生物学方式筛选伯氏疟原虫配子体蛋白(PlasmodiumbergheiGametocyte37，PbG37，PBANKA_060330)。并确定疟原虫有性生殖阶段表达的PbG37的基因结构特点。PbG37是分子量为40207Da的保守膜蛋白，存在一个信号肽、两个低度复杂区及七个跨膜区，与其他疟原虫株高度同源。随后，应用原核表达系统成功地表达并纯化了可溶性的重组蛋白rPbG37，经动物免疫，收获免疫血清。利用该血清对PbG37进行定位，为进一步功能的研究提供新的理论与实验依据。然后，利用基因打靶技术敲除PbG37，获得pbg37基因敲除型疟原虫株Δpbg37，并对Δpbg37进行了详细的表型与生物学功能研究，明确pbg37基因对疟原虫生活史的影响；以及利用前期制备的重组蛋白rPbG37获得的免疫血清，鉴定PbG37的生物学功能和传播阻断效应，为疟疾疫苗的研制开发打下基础。本专利技术所利用的基因打靶技术，其原理是利用活细胞基因组DNA可与外源性DNA的同源序列发生同源重组，对预先选择的基因进行定点修饰以达到改变基因组中某一特定基因的目的。该技术的优点是能将外源基因引入到疟原虫基因组DNA的特定片段上，并靶向敲除目的基因，而靶向引入本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种伯氏疟原虫配子体重组蛋白rPbG37，其特征在于，所述的重组蛋白的核酸序列为SEQ ID NO：1。

【技术特征摘要】
1.一种伯氏疟原虫配子体重组蛋白rPbG37，其特征在于，所述的重组蛋白的核酸序列为SEQIDNO：1。2.如权利要求1所述的伯氏疟原虫配子体重组蛋白PbG37，其特征在于，所述的重组蛋白的氨基酸序列为与序列SEQIDNo.1限定的氨基酸序列同源性在95-100％编码相同功能蛋白质的氨基酸序列；或SEQIDNo.1所示的氨基酸序列经增加、缺失或替换一个或多个氨基酸且具有同等活性的衍生的蛋白。3.如权利要求1-2任一所述的伯氏疟原虫配子体重组蛋白PbG37，其特征在于，所述的基因核苷酸序列为S...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹雅明，刘飞，王庆辉，冯辉，王亚茹，李莉，杨帆，洪民生，
申请(专利权)人：中国医科大学，
类型：发明
国别省市：辽宁,21