玉米核雄性不育基因ms30-6028在广泛遗传背景下的不育稳定性分析方法及应用技术

本发明专利技术涉及一种玉米隐性核雄性不育突变基因ms30‑6028在广泛遗传背景下导致雄花不育的稳定性分析方法及其应用。本发明专利技术通过杂交的方式将ms30‑6028突变基因导入329份不同遗传背景玉米自交系，对F2代植株育性分离比进行统计，并利用突变体基因ms30‑6028的共分离功能标记进行基因型分析，结果显示不育突变基因ms30‑6028在所有329个遗传背景下均表现完全雄花不育，证明其导致稳定的雄花彻底不育，可用于玉米杂交育种和不育化制种中母本的创制。本发明专利技术提供的不育突变基因导致雄花彻底不育的稳定性分析方法，同样可用于检测其它玉米隐性核雄性不育基因在不同遗传背景下的雄花彻底不育稳定性。

Sterility Stability Analysis of Maize Nuclear Male Sterility Gene ms30-6028 under Wide Genetic Background and Its Application

The present invention relates to a method for stability analysis of Recessive Genic Male Sterile Mutant Gene ms30 6028 in Maize under wide genetic background and its application. The present invention introduced the ms30 6028 mutant gene into 329 maize inbred lines with different genetic backgrounds by hybridization, counted the fertility segregation ratio of F2 generation plants, and analyzed the genotype of the mutant gene ms30 6028 by using the co-segregation functional markers. The results showed that the male sterility mutant gene ms30 6028 showed complete male sterility in all 329 genetic backgrounds, which proved that it caused the male sterility. The stable male flower is completely sterile, which can be used for the creation of female parent in maize hybrid breeding and sterilization. The method for stability analysis of male flower complete sterility caused by sterile mutant gene provided by the invention can also be used to detect the stability of other recessive nuclear male sterile genes in male flower complete sterility under different genetic backgrounds.

【技术实现步骤摘要】
玉米核雄性不育基因ms30-6028在广泛遗传背景下的不育稳定性分析方法及应用
一般地，本专利技术属于作物遗传育种、分子育种和种子工程领域。具体涉及一种玉米隐性核雄性不育基因ms30-6028在广泛遗传背景下的不育稳定性分析方法及应用。
技术介绍
植物雄性不育(malesterility,MS)是指在高等植物中，雄性生殖器官发育异常，无法产生有功能的雄配子(花粉)，但雌性生殖器官发育正常，能接受正常雄配子而受精结实，并能将该不育性状遗传给后代的现象。玉米是重要的粮食和经济作物，其雄性不育材料对于玉米花药发育机理的解析以及杂交种生产均具有重要意义。根据遗传方式的差异，现有的玉米雄性不育材料主要分为两类：核质互作雄性不育(Cytoplasmicmalesterility,CMS)和细胞核雄性不育(Genicmalesterility,GMS)。CMS的败育一般由线粒体毒性蛋白引起，部分种质的细胞核中存在恢复基因，可解除毒性蛋白的影响；因恢复基因仅存在于部分种质资源中，其不育程度受到遗传背景的影响，该特征大大降低了种质资源利用效率；且CMS育成品种细胞质单一化，易受专一病源小种的侵染，不宜大面积推广。GMS是由单一的细胞核基因突变引起的雄性不育现象，理论上所有的可育种质材料均可作为恢复系恢复其后代育性，该特征极大地增加了种植资源利用效率；且该类基因非母性遗传，不会导致细胞质单一化，降低了杂种后代潜在的风险，可作为杂交制种的理想母本材料。相较于CMS，GMS具有恢复基因广泛存在、不会引起细胞质单一化等优点，但该类基因在不同遗传背景下的稳定性并不明晰，因此将该基因导入不同细胞核及细胞质遗传背景下，并对后代分离群体的基因型进行鉴定，以判断该类突变基因在不同的遗传背景下所导致不育表型的稳定性具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种检测玉米细胞核雄性不育突变基因在不同的遗传背景下所导致雄性不育表型的稳定性分析方法。所提供的方法具体为，通过杂交技术及分子标记辅助选择，将玉米隐性核雄性不育基因导入不同的细胞核及细胞质遗传背景下，通过育性分析及基因型检测，判断玉米细胞核雄性不育基因在不同遗传背景下的所导致雄花不育表型的稳定性，为后续杂交育种和制种不育母本材料的选择提供参考。本专利技术的目的之一，在于提供一种鉴定玉米隐性核雄性不育基因在不同的遗传背景下导致雄花不育的稳定性分析方法。本专利技术的目的之二，在于提供329份不同遗传背景下ms30-6028基因纯合突变的种质材料，用于玉米雄性不育杂交育种和制种。附图说明图1为玉米野生型（A、C、E）和ms30-6028突变体（B、D、F）的雄穗、花药及花粉粒碘-碘化钾染色的对比图。图E、F中标尺为100μm。图2为不同发育时期野生型及ms30-6028突变体花药横切面（A）及小孢子发育（B）动态变化对比图。S7-S13，第7时期至第13时期；CMsp，败育小孢子；CP，败育花粉粒；Dy，二分体；E，表皮层；En，内皮层；ML，中间层；MLL，中间层状细胞；Msp，小孢子；P，花粉粒；PMC，花粉母细胞；Ta，绒毡层；Td，四分体。图中标尺为50μm。图3为329份广泛遗传背景的玉米自交系系统进化分析结果。基于3072个SNP标记的芯片分析，发现这329份玉米自交系分为四大类群，遗传多样性丰富，在杂交玉米育种和制种中有利用价值；同时该群体用于测试ms30-6028不育基因的不育稳定性具有代表性和可靠性。图4为ms30-6028突变基因在329份不同玉米种质遗传背景下所导致雄花不育性状稳定性分析的操作流程图。图5为F1代植株基因型鉴定所用引物示意图及鉴定结果电泳图。利用突变体基因ms30-6028的功能型标记ms30-IN1和ms30-IN3对F1代植株进行基因型鉴定。ms30-IN1和ms30-IN3在ZmMS30/ZmMs30纯合野生型中分别能扩增出859bp、739bp的条带，在ms30-6028/ms30-6028纯合突变体材料中分别扩增出396bp、276bp的条带，而在ZmMs30/ms30-6028杂合型材料中，则能分别扩增出对应的两条条带。图6为代表性F2群体中可育植株与不育植株分离比的统计数值及分离比的分布。根据可育单株与不育单株的真实比值，将329份材料分为三类，第一类包含36个系，其可育植株与不育植株的比值介于1.6和2.2之间，P值介于0.07和0.64之间；第二类包含248个系，其可育植株与不育植株的比值介于2.2和4.8之间，P值介于0.23和1.00之间；第三类包含45个系，其可育单株与不育单株的比值介于4.8和10.0之间，P值介于0.07和0.50之间。图7为6个代表性F2偏分离株系基因型鉴定电泳图。利用ms30-6028功能标记ms30-IN1对6个F2偏分离株系单株进行基因型鉴定，ms30-IN1在ZmMS30/ZmMs30纯合野生型中能扩增出859bp的条带，在ms30-6028/ms30-6028纯合突变体材料中能扩增出396bp的条带，而在ZmMs30/ms30-6028杂合型材料中，则能分别扩增出对应的两条条带。检测结果显示，6个F2株系中所有的可育单株基因型均为ZmMS30/ZmMs30或ZmMs30/ms30-6028，不育单株的基因型均为ms30-6028/ms30-6028，基因型与表型完全一致。图8为野生型、突变体及8个F2代表性株系中不育单株雄穗表型及花粉粒碘-碘化钾染色结果对比图。图中标尺为50μm。具体实施方式下述实施例用来说明本专利技术，但不限制本专利技术的范围。在不背离本专利技术精神和实质的情况下，对本专利技术方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本专利技术的范围。如无特殊说明，实施例中所用引物及基因的合成和测序均由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。其他生化试剂非特别注明外均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例1：获得玉米雄性不育突变材料及329份玉米自交系本专利技术的供试材料是玉米正常可育自交系的ZmMs30基因突变获得的不育株，表现为完全雄性不育，如图1所示，其表现具体为：花药变小、花粉不能被碘-碘化钾染色。更为精细的变化如图2所示，半薄切片结果（A）显示在第10发育时期及之前，突变体花药横切面与野生型相比无明显变化，但随后的去液泡化及淀粉填充过程未正常发生，而是表现为失水皱缩；扫描电镜结果（B）与半薄切片结果一致，显示突变体小孢子液泡化后开始皱缩，未发生再次膨胀的过程，最终未能形成正常形态的花粉粒。该不育系材料命名为ms30-6028。329份供试母本玉米自交系来源于本实验室1400份玉米自交系中随机选取，材料名称仍沿用原始编号。实施例2：329份玉米自交系群体结构鉴定首先利用包含3072个位点的IlluminaGoldenGateSNPGenotyping检测芯片对329份自交系材料进行分析，然后通过PHYLIPDNADIST程序计算不同材料之间的遗传距离(0-1.15)，根据遗传距离计算结果，利用PHYLIPNEIGHBOR软件构建系统发育树，对329份自交系材料进行分类。如图3所示，329份玉米自交系可分为4个组，代表了较好的多态性。实施例3：ms30-6028突变本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种玉米隐性核雄性不育突变基因ms30‑6028在不同遗传背景下的不育稳定性分析方法，其特征在于，以329份玉米自交系（ZmMs30/ZmMs30）为母本，以杂合突变体（ZmMs30/ms30‑6028）为父本，进行人工授粉；收获的329份F1代种子于下一种植季播种，在苗期，利用突变基因ms30‑6028的共分离功能性标记ms30‑IN1与ms30‑IN3筛选杂合体单株（ZmMs30/ms30‑6028），并在授粉期进行自交；对获得的329份F2代群体植株的育性分离比进行统计，卡方检验结果偏离3 : 1分离比的群体，对其所有单株ZmMs30等位位点的基因型进行鉴定，调查表型与基因型之间的一致性，以验证突变基因ms30‑6028在不同的细胞核及细胞质遗传背景下的不育稳定性。

【技术特征摘要】
1.一种玉米隐性核雄性不育突变基因ms30-6028在不同遗传背景下的不育稳定性分析方法，其特征在于，以329份玉米自交系（ZmMs30/ZmMs30）为母本，以杂合突变体（ZmMs30/ms30-6028）为父本，进行人工授粉；收获的329份F1代种子于下一种植季播种，在苗期，利用突变基因ms30-6028的共分离功能性标记ms30-IN1与ms30-IN3筛选杂合体单株（ZmMs30/ms30-6028），并在授粉期进行自交；对获得的329份F2代群体植株的育性分离比进行统计，卡方检验结果偏离3:1分离比的群体，对其所有单株ZmMs30等位位点的基因型进行鉴定，调查表型与基因型之间的一致性，以验证...

【专利技术属性】
技术研发人员：万向元，田有辉，张思淼，李紫文，安学丽，朱涛涛，鲍建喜，刘欣洁，李金萍，
申请(专利权)人：北京科技大学，北京首佳利华科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11