核苷酸组合物、试剂盒及检测方法技术

本申请公开了一种核苷酸组合物和包含该核苷酸的试剂盒及检测方法。当待测样品中包含待测目标分子时，利用本发明专利技术设计的组合物二和引物对通过非对称PCR反应，可获得大量单链产物，这些单链产物可与利用本发明专利技术设计的组合物一制备好的银纳米簇探针杂交结合后会发出荧光，从而实现待测目标分子的可视性检测，本发明专利技术克服传统方法依赖于仪器判别的缺点，建立一种不依赖于复杂仪器的可视化、可定性定量的检测新方法，丰富了现有检测技术和方法，为以后银纳米簇在转基因方面的应用提供了思路和技术基础。在一个具体的实施方式中，本发明专利技术建立的组合物和方法的灵敏度达到0.5ng/μL且重复性好、特异性高。

Nucleotide Composition, Kit and Detection Method

The present application discloses a nucleotide composition, a kit containing the nucleotide and a detection method. When the target molecule is contained in the sample to be tested, a large number of single-chain products can be obtained by asymmetric PCR reaction using the composition 2 and primer pairs designed by the invention. These single-chain products can emit fluorescence when hybridized with silver nanocluster probes prepared by the composition 1 of the invention, thereby realizing the visibility detection of the target molecule to be measured. The invention overcomes the tradition. The method relies on the disadvantage of instrumental discrimination, and establishes a new visualization, qualitative and quantitative detection method that does not depend on complex instrumentation. It enriches the existing detection techniques and methods, and provides ideas and technical basis for the future application of silver nanoclusters in genetically modified organisms. In a specific embodiment, the sensitivity of the composition and method established by the present invention is up to 0.5ng/mu L with good repeatability and high specificity.

【技术实现步骤摘要】
核苷酸组合物、试剂盒及检测方法
本申请涉及分子生物学
，具体而言，涉及一种核苷酸组合物、包含该核苷酸组合物的试剂盒及检测方法。
技术介绍
我国于2002年7月开始实施《转基因食品卫生管理条例》，对转基因食品产品进行标识管理。目前国际上常用的转基因产品检测方法主要有酶联免疫检测(ELISA)、PCR-电泳检测、荧光定量PCR检测等技术，但这些技术对于大量转基因品系的检测数，往往需要专业的仪器，成本较高，且数据需要进行分析后才能得出结果。因此对于转基因作物的可视性检测技术进入人们的视野。邓婷婷等均有采取过可视化芯片法对转基因玉米Mir162进行检测，检测限可达0.01％；成晓维对转基因大豆、玉米和水稻中的转基因成分进行检测，灵敏度达0.1％。但由于基因芯片技术操作较为复杂，在PCR反应过程后，仍需要清洗、封闭、显色等步骤才能判别结果，繁琐的步骤限制了这些方法在实验室的常规应用。金属纳米簇(NCs)在过去十年中发展非常快的纳米材料。其特点是在不大于2nm的尺寸内包含最多几百个分子，并由此展现出类似于分子的特征。并且由于自身尺寸、氧化态、结构和表面基团的性质，使得金属纳米簇具备展现出较强的荧光性质。而相比于金纳米簇，银纳米簇拥有可以在水溶液中表现出更强的荧光的特点，引起了广泛的研究。
技术实现思路
本专利技术提供了一种核苷酸组合物，包括组合物一和组合物二，组合物一包括由银纳米簇成核序列和识别序列组成的序列，用于与银纳米离子结合形成银纳米簇；组合物二包括由银纳米簇激发序列的杂交互补序列和识别序列组成的序列，组合物一中的识别序列和组合物二中的识别序列具有相同的核苷酸序列；组合物二的序列的杂交互补序列可与组合物一结合，所得产物可激发银纳米簇发出荧光；组合物还包括一引物对，引物对包括引物1和引物2，引物1与组合物二连接；引物对为可特异性扩增靶标序列的序列。进一步的，银纳米簇成核序列为富C序列；所述银纳米簇激发序列为富G序列；识别序列为富A、T序列。具体的，所述富G序列包括可自发组装成G-4链体的核苷酸序列。富C、富A、T序列是指序列中碱基C、碱基A、T的含量在30％以上。引物1与引物2的摩尔比在1:30以下。组合物一中银纳米簇成核序列的3’端与识别序列的5’端连接；组合物二中银纳米簇激发序列的杂交互补序列的3′端与识别序列的5’端连接，引物1的5′端与组合物二的识别序列的3′端连接。优选的，银纳米簇成核序列为序列表中SEQID№：7所示核苷酸序列；银纳米簇激发序列的杂交互补序列为序列表中SEQID№：4所示核苷酸序列；识别序列为序列表中SEQID№：5所示核苷酸序列；引物1与引物2的摩尔比为1:60。本专利技术还提供一种试剂盒，该试剂盒包括前述核苷酸组合物和银纳米离子。本专利技术还提供一种检测方法，该方法包括：利用组合物一制备银纳米簇探针；利用靶标序列、组合物二和引物对进行非对称PCR反应；非对称PCR产物与银纳米簇探针杂交结合。其中，组合物一包括由银纳米簇成核序列和识别序列组成的序列，银纳米簇成核序列可与银纳米离子结合形成银纳米簇；组合物二包括由银纳米簇激发序列的杂交互补序列和识别序列组成的序列，组合物一中的识别序列和组合物二中的识别序列具有相同的核苷酸序列；组合物二的序列的杂交互补序列可与组合物一结合，所得产物可激发银纳米簇发出荧光；组合物还包括一引物对，引物对包括引物1和引物2，引物1与组合物二连接；引物对为可特异性扩增靶标序列的序列。进一步的，利用组合物一制备银纳米探针方法包括：将组合物一的水溶液与磷酸钠缓冲液混和，再与硝酸银溶液混合，然后加入NaBH4溶液混和后室温避光孵育14小时以上。具体的，磷酸缓冲液pH＝6.6，浓度为20mM；硝酸银溶液浓度为3mM；NaBH4溶液浓度为1.5mM。非对称PCR反应体系中引物1与引物2的摩尔比在1:30以下。非对称PCR产物与银纳米簇探针杂交结合包括将非对称PCR反应完成后的反应体系与制备好的银纳米簇探针溶液混合，90-95℃水浴1min，冷却至室温。银纳米簇成核序列为富C序列；银纳米簇激发序列为富G序列；识别序列为富A、T序列。具体的，所述富G序列包括可自发组装成G-4链体的核苷酸序列。富C、富A、T序列是指序列中碱基C、碱基A、T的含量在30％以上。组合物一中银纳米簇成核序列的3’端与识别序列的5’端连接；组合物二中银纳米簇激发序列的杂交互补序列的3′端与识别序列的5’端连接，引物1的5′端与组合物二的识别序列的3′端连接。非对称PCR反应体系总体积为25μl，1μl浓度为1uM的组合物二+引物1，1μl浓度为10uM的引物2，2μl的dNTP，0.2μlTaq酶，2μl靶标DNA，10μl10xBuffer，余量为超纯水；非对称PCR反应条件：95.0℃变性5min，95.0℃变性30s，54℃退火30s，72.0℃延伸30s，循环39次，72.0℃延伸10min。优选的，Ag+与组合物一摩尔比例为6:1。室温避光孵育14-22小时。非对称PCR反应体系中引物1与引物2的摩尔比为1:60。银纳米簇成核序列为序列表中SEQID№：7所示核苷酸序列；银纳米簇激发序列的杂交互补序列为序列表中SEQID№：4所示核苷酸序列；识别序列为序列表中SEQID№：5所示核苷酸序列。本专利技术还提供一种转基因作物的可视性检测方法，包括：制备银纳米簇探针将组合物一的水溶液与磷酸钠缓冲液混匀，再与硝酸银溶液混合，使Ag+与组合物一摩尔比例为6:1，然后快速加入NaBH4溶液混匀后室温避光孵育14小时；组合物一的序列为序列表中SEQID№：3所示核苷酸序列。非对称PCR扩增非对称PCR反应体系总体积25μl，1μl浓度为1uM的组合物二5’端连接引物1，1μl浓度为10uM的引物2,2μl的dNTP，0.2μlTaq酶，2μl待测转基因作物样品DNA，10μl10xBuffer，余量为超纯水。其中，组合物二的序列由序列表中SEQID№：4所示核苷酸序列3’端连接序列表中SEQID№：5所示核苷酸序列组成；引物1和引物2为根据转基因作物外源基因所设计的特异性扩增引物对，引物1与引物2的摩尔比为1:60；待测转基因作物样品DNA浓度大于0.5ng/μL。非对称PCR反应条件：95.0℃变性5min，95.0℃变性30s，54℃退火30s，72.0℃延伸30s，循环39次，72.0℃延伸10min。非对称PCR产物与银纳米簇探针杂交结合将非对称PCR反应完成后的反应体系加到制备好的银纳米簇探针溶液中。混匀，90-95℃水浴1min，冷却至室温。紫外光下检测。本专利技术的检测方法，当待测样品中包含待测目标分子时，通过非对称PCR反应，可获得大量单链产物，这些单链产物同时拥有银纳米簇激发序列、识别序列的杂交互补序列，这些单链产物与利用组合物一制备好的银纳米簇探针杂交结合后会发出荧光，从而实现待测目标分子的可视性检测。本专利技术的有益效果包括：1、无需特殊的荧光标记，节约了实验成本。2、借助非对称扩增实现了单双链的转化，增加了该方法的特异性，减少了假阳性。3、扩增结果与片段长度无关，易于设计引物。4、根据设计原理可做推广去检测不同的转基因筛选序列或者品系，只需要将用于扩增目标待测靶基因的常规引物序列与激发本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种核苷酸组合物，包括组合物一和组合物二，所述组合物一包括由银纳米簇成核序列和识别序列组成的序列，所述银纳米簇成核序列用于与银纳米离子结合形成银纳米簇；所述组合物二包括由银纳米簇激发序列的杂交互补序列和识别序列组成的序列，所述组合物一中的识别序列和组合物二中的识别序列具有相同的核苷酸序列；所述组合物二的序列的杂交互补序列可与所述组合物一结合，所得产物可激发银纳米簇发出荧光；其特征在于，所述核苷酸组合物还包括一引物对，所述引物对包括引物1和引物2，所述引物1与所述组合物二连接；所述引物对为可特异性扩增靶标序列的序列。

【技术特征摘要】
1.一种核苷酸组合物，包括组合物一和组合物二，所述组合物一包括由银纳米簇成核序列和识别序列组成的序列，所述银纳米簇成核序列用于与银纳米离子结合形成银纳米簇；所述组合物二包括由银纳米簇激发序列的杂交互补序列和识别序列组成的序列，所述组合物一中的识别序列和组合物二中的识别序列具有相同的核苷酸序列；所述组合物二的序列的杂交互补序列可与所述组合物一结合，所得产物可激发银纳米簇发出荧光；其特征在于，所述核苷酸组合物还包括一引物对，所述引物对包括引物1和引物2，所述引物1与所述组合物二连接；所述引物对为可特异性扩增靶标序列的序列。2.根据权利要求1所述的核苷酸组合物，其特征在于包括以下(1)-(5)的一项或多项：(1)所述银纳米簇成核序列为富C序列；所述银纳米簇激发序列为富G序列；(2)所述识别序列为富A、T序列；(3)所述引物1与所述引物2的摩尔比在1:30以下；(4)所述组合物一中银纳米簇成核序列的3’端与识别序列的5’端连接；(5)所述组合物二中银纳米簇激发序列的杂交互补序列的3′端与识别序列的5’端连接，所述引物1的5′端与所述组合物二的所述识别序列的3′端连接。3.根据权利要求1或2所述的核苷酸组合物，其特征在于，包括下述1)-4)中的至少一种：1)所述银纳米簇成核序列为序列表中SEQID№：7所示核苷酸序列；2)所述银纳米簇激发序列的杂交互补序列为序列表中SEQID№：4所示核苷酸序列；3)所述识别序列为序列表中SEQID№：5所示核苷酸序列；4)所述引物1与所述引物2的摩尔比为1:60。4.一种试剂盒，其特征在于包括银纳米离子和权利要求1-3任一项中的核酸组合物。5.一种检测方法，其特征在于，所述方法包括，利用组合物一制备银纳米簇探针；利用靶标序列、组合物二和引物对进行非对称PCR反应；非对称PCR产物与所述银纳米簇探针杂交结合；其中，所述组合物一包括由识别序列和银纳米簇成核序列组成的序列，所述银纳米簇成核序列可与银纳米离子结合形成银纳米簇；所述组合物二包括由银纳米簇激发序列的杂交互补序列和识别序列组成的序列，所述组合物一中的识别序列和组合物二中的识别序列具有相同的核苷酸序列；所述组合物二的序列的杂交互补序列可与所述组合物一结合，所得产物可激发银纳米簇发出荧光；其特征在于，所述核苷酸组合物还包括一引物对，所述引物对包括引物1和引物2，所述引物1与所述组合物二连接；所述引物对为可特异性扩增靶标序列的序列。6.根据权利要求5所述的一种检测方法，其特征在于包括以下(1)-(7)的一项或多项：(1)所述利用组合物一制备银纳米探针方法包括：将组合物一的水溶液与磷酸钠缓冲液混和后，再与硝酸银溶液混合，然后再加入NaBH4溶液混和后室温避光孵育14小时以上；(2)所述非对称PCR反应体系中所述引物1与所述引物2的摩尔比在1:30以下；(3)所述非对称PCR产物与银纳米簇探针杂交结合包括将非对称PCR反应完成后的反应体系制备好的银纳米簇探针溶液混和，90-95℃水浴1...

【专利技术属性】
技术研发人员：许文涛，罗云波，牛晨启，黄昆仑，徐瑗聪，杜再慧，贺晓云，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京,11